低温对保加利亚乳杆菌C spA基因表达影响的研究

董至恒，石瑞文，包小妹，王玉华，张烨，关海滨，*

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学附属医院药剂部，内蒙古呼和浩特 010110）

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）属于德氏乳杆菌属保加利亚亚种，革兰染色阳性、兼性厌氧、不移动、不产芽孢的乳酸菌（lactic acid bacterium，LAB）[1]，因其能赋予酸奶独特的口味，目前被广泛应用于酸奶的发酵。此外，保加利亚乳杆菌具有调节肠道菌群平衡、增强免疫力、抵御病原微生物的侵袭等生理作用，因此被广泛应用于保健品及药品的主要成分[2]。保加利亚乳杆菌可通过液体发酵的方法大量获得，并通过冷冻干燥的方法制得菌粉，菌粉是菌种的最佳保存方式，因此可用作酸奶的直投式发酵剂、药品以及保健品领域。

在工业生产过程中，冻干过程会对保加利亚乳杆菌造成严重损伤，主要表现在冰晶的形成对细胞膜产生的机械性损伤，蛋白质的变性失活，细胞膜通透性的改变，DNA损伤等因素[3-4]。然而菌体为了适应低温环境，也会产生冷应激反应，生成一系列的抗低温蛋白，即冷休克蛋白（cold shock proteins，CSPs）来抵御低温环境对菌体造成的损伤[5-8]。这是一类分子量约为7.5 kD的小分子蛋白，CSPs均为诱导型蛋白，在大肠杆菌中（E.coli）发现 9种 CSPs，其中 CspA、CspB、CspG、CspI 4种可被低温诱导，其余CSPs在特定的生长期产生，CPSs家族约45%的序列具有同源性[9]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的CSPs家族具有3种类似CspA的蛋白，分别为CspB、CspC、CspD，3种蛋白均可被低温诱导产生，并且是菌体适应低温环境所必须的[10]。CSPs具有多种生理功能，其结构包含2个保守的RNA结合区域，可结合RNA或单链DNA，可作为RNA的分子伴侣阻止RNA二级结构的形成，并可以作为翻译的激活因子（Transcription activators）、翻译抗终止子（Transcription antiterminators）或替代翻译起始因子（Alternative translation initiation factors），促进蛋白的翻译[9-12]。

本文对保加利亚乳杆菌进行低温处理，以诱导冷休克蛋白的生成，通过荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的方法检测CspA的表达，确定CspA的最佳诱导条件，并证明菌体的冻融存活率和冻干存活率与CspA的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌源

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）GD20150321：内蒙古医科大学药学院生物制药实验室保存。

1.1.2 试剂和仪器

MRS液体培养基：葡萄糖1.5%、酪蛋白胨1%、酵母粉1%、牛肉粉0.5%、乙酸钠0.5%、柠檬酸三铵0.2%、吐温-80 0.1%、MgSO40.05%、K2HPO40.05%。用5%的NaOH调节pH为6.6～6.8。

MRS固体培养基：MRS液体培养基加入1.5%的琼脂。以上培养基121℃灭菌30 min，至4℃冰箱保存。所有试剂均为分析纯。ViiA7型荧光定量PCR仪：美国ABI；Mini-sub cell GT电泳仪：美国Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 保加利亚乳杆菌的四级发酵培养

液体发酵培养采取四级培养的方法，一、二、三级为种子培养基，四级为发酵培养基，一级种子培养基接入冻干菌种，放置恒温厌氧培养箱37℃静置培养12 h。二级种子培养基由培养好的一级种子液按5%的接种量接入，培养8 h。以此类推，传代到四级发酵。

1.2.2 发酵液活菌数的测定

采用平板混菌计数法，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）10 倍逐级稀释发酵液至 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后吸取 1 mL 稀释液加入到灭菌的空白平皿中，每个样平行做3块平皿，再倒入融化的50℃～55℃MRS固体培养基 15 mL～20 mL，摇匀，待培养基凝固后，将平皿倒置放于37℃恒温厌氧培养箱中，培养48 h后计数，方法参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。

1.2.3 保加利亚乳杆菌的生长曲线测定

四级发酵液按不同的时间点（0、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20 h）取样，平板混菌计数法测定发酵液活菌数，制作生长曲线。

1.2.4 保加利亚乳杆菌CspA基因的克隆以及RTPCR法检测mRNA的表达量

利用Prime5.0软件设计RT-PCR法检测CspA基因的引物，引物序列（F：5‘-TTGCCTTGTTCAACATCGTA’，R：5‘-GGGCTTTGGGTTTATCAC-3’），产物长度123bp，引物由Invitrogen公司合成。提取保加利亚乳杆菌总RNA，按 RNAiso Plus（D9108A Takara）试剂盒说明书方法操作，提取得到的RNA溶液，用酶标仪检测OD260与OD280的比值，比值1.8～2.0为符合要求的RNA。

按照PrimeScript RT reagent Kit（DRR037A Takara）试剂盒说明操作，RNA 上样量为 2.0 μL（约 500 ng），反应条件：37℃，15 min；85℃，5 s结束反应，获得cDNA。

荧光定量PCR，按照SYBRPremixExTaq（DRR041A Takara）说明书方法操作，以cDNA为模板，加入CspA的引物，通过实时荧光定量PCR（Real time PCR，RTPCR）方法扩增CspA基因。反应条件：预变性95℃30 s；变性95℃5 s，退火60℃34 s读板，共40个循环；从65℃到95℃制作融解曲线。以16srDNA为内参基因（长度210 bp），以确定CspA的相对表达量。产物做电泳检测分析，并测序分析。

1.2.5 保加利亚乳杆菌低温诱导CspA试验

将保加利亚乳杆菌四级发酵液分别置于5、10、15、20、37 ℃的恒温水浴中分别处理 0.5、1、2、4、6 h，即按照5组（温度）×5组（时间）设计，共25组试验，每组试验设3个重复，37℃为对照组。RT-PCR法检测CspA的表达量。

1.2.6 反复冻融法测定低温诱导后保加利亚乳杆菌的存活率

将保加利亚乳杆菌四级发酵液分别置于10、15、20、37 ℃的恒温水浴中分别处理 1、2、4、6 h，即按照 4组（温度）×4组（时间）设计，共16组试验，每组试验设3个重复，37℃为对照组。并将菌液于-20℃以及25℃反复冻融8次，平板混菌计数法测定发酵液的活菌数，计算冻融存活率（冻融后的活菌数/冻融前的活菌数）。

1.2.7 保加利亚乳杆菌冻干验证试验

保加利亚乳杆菌四级发酵液经10 000 r/min离心15 min，弃去上清液，收集菌体，加入冻干保护剂（冻干保护剂：25%脱脂奶粉、10%乳糖、10%抗坏血酸）混匀，-40℃预冷30 min，真空干燥24 h得到冻干菌粉。精密称取1.00 g菌粉悬溶于10 mL PBS中混匀，平板混菌计数法测定混悬液的活菌数。为了考察低温诱导和冻干保护剂对菌体抗冻性的影响，发酵液按照最佳温度和时间进行低温诱导处理，试验分为4组，每组设3个重复。（A）空白对照组、（B）加保护剂组、（C）低温诱导组、（D）保护剂+低温诱导组，计算各组样品的冻干存活率（冻干菌粉总活菌数/发酵液总活菌数）。

1.3 数据处理

RT-PCR所获得的数据，利用2-ΔCt（扩增循环数）（ΔCt=CspA Ct值－16srDNA Ct值）公式进行 CspA基因在保加利亚乳杆菌中相对表达量计算。

试验数据均采用平均值和标准误差（SEM）表示，应用Tukeytest检验进行分析，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 保加利亚乳杆菌生长曲线结果

保加利亚乳杆菌生长曲线如图1。

图1 保加利亚乳杆菌生长曲线Fig.1 Growth curve of Lactobacillus bulgaricus

如图1所示，保加利亚乳杆菌生长良好，0～2 h是菌体的适应期，2 h～6 h是菌体的对数生长期，6 h～12 h是菌体的稳定生长期，12 h～20 h菌体进入衰退期。

2.2 保加利亚乳杆菌CspA基因克隆及电泳结果

保加利亚乳杆菌CspA基因克隆电泳结果见图2。

图2CspA基因RT-PCR电泳结果Fig.2 Electrophoresis result of CspA RT-PCR product

如图2所示保加利亚乳杆菌CspA基因克隆片段，大小为123 bp，产物经电泳、胶回收、测序、测序结果在Genbank上比对，确认为目标基因。

2.3 保加利亚乳杆菌低温诱导CspA试验结果

低温诱导后CspA mRNA的相对表达量见图3。

图3 低温诱导后CspA mRNA的相对表达量Fig.3 Relative mRNA expression of CspA after low temperature treatment

如图3所示，保加利亚乳杆菌四级发酵液在不同的诱导温度（5、10、15、20℃）条件下，以及不同的诱导时间（0.5、1、2、4、6 h）条件下，并以 37 ℃作为对照，RT-PCR法检测菌体CspA mRNA的表达量。用SPSS17.0软件对数据进行分析，结果显示，在37℃时，不同的时间内其表达量没有显著变化，说明时间不会对CspA mRNA的表达量造成影响。而在低温诱导下，菌体CspA mRNA的表达量均有不同程度的提高，说明低温可以诱导菌体产生CspA，且在20℃诱导4 h，菌体CspA的表达量最高，且差异显著（P＜0.01）。

2.4 反复冻融法测定低温诱导后保加利亚乳杆菌的存活率结果

不同诱导时间和温度条件下，低温诱导后菌体的冻融存活率见图4。

图4 不同诱导时间及诱导温度条件下菌体的冻融存活率Fig.4 Freeze-thawing survival rate of cells after low temperature treatment with the condition of different administration time

保加利亚乳杆菌四级发酵液在不同的诱导温度（10、15、20℃）条件下，以及不同的诱导时间（1、2、4、6 h）条件下，并以37℃作为对照组，平板计数法检测发酵液的活菌数，并计算冻融存活率。用SPSS17.0软件对数据进行分析。如图4所示，在37℃时，菌体的存活率随着冻融循环次数的增加而显著降低，经过8次冻融循环后，菌体存活率为14%，差异显著（P<0.01）。而在低温诱导下，菌体的冻融存活率明显高于对照组，说明低温诱导可以明显提高菌体的抗冻性，并且在20℃、4 h条件下菌体的冻融存活率最高，经过8次冻融循环后，存活率达64%，差异显著（P<0.01）。

2.5 保加利亚乳杆菌冻干验证试验结果

在保加利亚乳杆菌冻干过程中通常需要加入一定量的保护剂，以减轻冻干对菌体的损伤，为了考察CspA对菌体冻干的保护效果，以及CspA与冻干保护剂对菌体冻干的协同保护作用，将试验分为4组，A空白对照组、B加保护剂组、C低温诱导组、D保护剂+低温诱导组，以A组为对照，对比其它组的冻干相对存活率。平板计数法检测冻干菌粉的活菌数，并计算冻干存活率。用SPSS17.0软件对数据进行分析。结果见图5。

图5 菌体冻干存活率验证结果Fig.5 Testify result of freeze-drying survival rate of cells

如图5所示，A组的冻干存活率约为12%；B组加入冻干保护剂后其相对冻干存活率约为32%，说明冻干保护剂对菌体的存活率起到了明显的效果；C组中菌体经低温诱导产生CspA后，其冻干存活率约为29%，说明CspA可以保护菌体减少冻干对菌体的损伤；D组加入冻干保护剂并低温诱导菌体，其冻干存活率约为57%，差异显著（P<0.01），说明冻干保护剂和CspA具有协同或相加的作用，共同保护菌体，提高了菌体的抗冻性。

3 讨论

冷休克蛋白在细胞水平上发挥了重要作用，CspA的mRNA能在低温条件下表达，并且翻译出CspA蛋白，CspA可作为转录因子促进冷诱导基因的表达，并且CspA还可结合单链DNA及RNA，从而影响其基因表达功能[1，13-15]。研究显示，对嗜热链球菌进行20℃、4 h的低温处理，其存活率可提高1 000倍[16-17]。枯草芽孢杆菌经18℃低温处理后，有大约50种参与氨基酸与核酸合成的mRNA的表达降低，同时约50中mRNA的表达升高，表达最强的是脂肪酸脱氢酶基因，其作用是将饱和脂肪酸脱氢成为不饱和脂肪酸，增强细胞膜的流动性，从而提高抗冻性。

本研究对保加利亚乳杆菌进行不同温度和时间的低温处理，以考察CspA的最佳诱导条件，并考察菌体的冻融存活率和冻干存活率，结果发现，在20℃、4 h诱导条件下其CspA的表达量最高，且低温诱导可以显著提高保加利亚乳杆菌的冻融存活率和冻干存活率，说明CspA在抵御低温对菌体的损伤、提高冻融存活率和冻干存活率方面发挥了重要作用。由此可知，在发酵结束后，对保加利亚乳杆菌进行低温诱导，促进其CspA的表达，可以明显提高菌体的冻干存活率，提高冻干菌粉的活菌数，对于菌粉的工业生产有一定的指导意义。

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