超声微波协同萃取柚皮总黄酮及其抗氧化性研究

李志锐，乐粉鹏，王娟，韩淑琴，*

（1.中山职业技术学院，广东中山528404；2.中国检验检疫科学研究院，北京100176；3.贵州轻工职业技术学院，贵州贵阳550025）

我国是柚子的生产大国，柚子种植面积和产量均居世界首位，但由于受多重因素的限制，柚果深加工的程度很低，国人多以鲜食为主。因此，占柚子总量约为45%的柚皮，除极少部分直接作为中药材或作为提取果胶和香精油的原料外，90%以上以废弃物的形式直接排入环境。柚子皮中含有可观的黄酮类物质，它在碱性条件下，经氢化处理，可得到高甜度、低能量的柚皮甙二氢查尔酮，其甜度是蔗糖的1000倍。柚皮甙在柚皮中的含量约3%～5%[1-9]，具有抗过敏、降血压、消炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、保肝和降血脂等活性，在食品和医学上得到广泛应用。在食品工业上可作抗氧化剂、色素和甜味剂等，在医学上对治疗冠心病、脑血栓和消除自由基等方面有显著效果。

文章着重对柚皮提取总黄酮的工艺进行了研究，笔者在全面考虑已有提取方法的优缺点及现有条件的基础上，以黄酮得率为指标，选用超声微波协同萃取法（Ultrasonic microwave co extraction，UMAE），通过单因素试验和正交试验，确定较优的提取工艺参数，并采用DPPH自由基对提取的总黄酮粗品作了抗氧化性的测定，以期为提高柚子综合利用率，提升柚子的经济效益提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

柚子：采自广东省；柚子表皮粉末：中山职业技术学院基础分析实验室自制。

1.1.2 主要试剂

芦丁标准品：中国药品生物制品检定所；无水乙醇（AR，批号20100821）：广东光华化学厂有限公司；DPPH：合肥博美生物科技有限责任公司；其他试剂均为市售分析纯。

1.1.3 主要仪器

T6新锐可见光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；CW-2000超声-微波协同萃取仪：新拓微波溶样测试技术有限公司；JJ500电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；双圈牌定性滤纸：杭州沃华滤纸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的制作

精密吸取芦丁标准品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于25 mL比色管中，用30%乙醇稀释至1.0 mL，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，放置6 min后，加10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，放置6 min后，再加入1 mol/L氢氧化钠4 mL，加水至10 mL的刻度，摇匀，放置 15min 后，在 510nm 波长测定[1，3-19]。

1.2.2 样品的测定

取样品液2 mL置于25 mL比色管中，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，放置6 min后，加10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，放置6 min后，再加入1 mol/L氢氧化钠4 mL，加水至10 mL的刻度，摇匀，放置15 min后，在510 nm波长测定。

1.2.3 单因素试验

以黄酮提得率为评价指标，分别考察不同提取时间（10、15、20、25、30、35 s）、不同料液比（g/mL）（1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40）、不同提取功率（70、75、80、85、90、95 W）、不同乙醇浓度（60%、65%、70%、75%、80%、85%）下对柚皮黄酮提取得率的影响。

1.2.4 正交试验

根据单因素试验结果，以黄酮提得率为考察指标，以提取时间、料液比、提取功率、乙醇浓度为考察因素，各取3个水平，进行正交试验，以确定提取柚子皮中黄酮的最佳工艺条件，正交试验因素与水平设计见表1。

表1 L9（34）正交试验因素与水平设计Table 1Factor and level of L9（34）orthogonal test

1.2.5 黄酮得率的测定

总黄酮得率/%＝c×v×n/m×100

式中：c为有标准曲线计算得到的总黄酮浓度，（mg/mL）；v为待测液的体积，mL；n为浸提液稀释的倍数；m为每份柚子表皮粉末的质量，mg。

黄酮得率/%=（黄酮提取量/柚子皮质量）×100

1.2.6 柚子表皮黄酮类化合物的抗氧化活性的测定

1.2.6.1 DPPH溶液的配制

准确称取19.72mgDPPH试剂，用甲醇溶解并定容于100mL容量瓶中，DPPH溶液浓度为0.5mmoL/mL，避光保存（0℃～4℃）。

1.2.6.2 提取物清除DPPH自由基活性的测定

每组试验中的柚子表皮提取液的浓度为相同值。

1）取柚子表皮提取液2mL及浓度为0.5mmol/mL的DPPH溶液2 mL先后加入同一具塞试管中，摇匀，在黑暗中37℃放置20 min，以65%乙醇为空白在514 nm测定其吸光度Ai。

2）取2 mL 0.5 mmol/mL的DPPH溶液与2 mL 65%乙醇混合，摇匀，在黑暗中37%放置20 min，以65%乙醇为空白在514 nm测定其吸光度A0。

3）取2 mL柚子表皮提取液与2 mL 65%乙醇混合，摇匀，在黑暗中37℃放置20 min，以65%乙醇为空白在514 nm测定其吸光度Aj。

根据下列公式计算柚子表皮提取液对DPPH自由基的抑制率，即

抑制率/%=[1－（Ai－Aj）/A0]×100

式中：Ai为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度；A0为末加抗氧化剂时DPPH与乙醇混合溶液的吸光度；Aj为柚子表皮提取液在测定波长的吸光度。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的制作

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

由图1可得，芦丁标准曲线方程为：y=11.529x+0.001 2。相关系数R2=0.999 2，直观的说明了其线性关系很好，相关性很强。在取5个点的芦丁标准曲线的数据中，相邻两位数值的差值较为稳定，说明其试验测得的数据准确度很高，可取性稳定。标准曲线的制作误差很小，同时也再次说明其可为之后的代入吸光值求取出的浓度值准确度会很高。

2.2 单因素试验

以柚皮黄酮提得率为评价指标，分别考察不同提取时间、不同料液比、不同提取功率、不同乙醇浓度下对柚皮黄酮提得率的影响，结果见图2～图5。

由图2～图5可知，在UMAE萃取柚皮中黄酮的最佳工艺条件为：提取时间为25 s，料液比为1∶25（g/mL），萃取功率为85 W，乙醇浓度为70%。在上述条件下，黄酮提得率可以达到0.27%。

2.3 正交试验

以柚皮黄酮提得率为评价指标，选定四因素三水平进行正交试验，因素水平见表1，正交结果见表2。

图2 提取时间对柚皮总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids from Pomelo Peel

图3 料液比对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of feed liquid ratio on the yield of total flavonoids

图4 萃取功率对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction power on the yield of total flavonoids

图5 乙醇浓度对总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

表2 柚子皮提取黄酮正交试验与结果Table 2 Orthogonal test and results of the extraction of flavonoids from the peel of grapefruit

经minitab15.0软件分析结果表明，以总黄酮得率为指标，乙醇浓度因素的极差最大，表明乙醇浓度对柚皮总黄酮的影响最大，各因素对总黄酮得率的影响程度依次为：乙醇浓度＞料液比＞提取时间＞提取功率，由此分析，总黄酮提取条件的最佳组合为A3B3C2D1，即在提取时间为30 s、料液比为1∶30（g/mL）、提取功率为85 W、乙醇浓度为65%时，总黄酮得率达到最大值。在上述条件下，做平行试验柚皮黄酮提得率平均可达到0.34%。

2.4 柚皮总黄酮的抗氧化活性的测定

不同黄酮浓度对DPPH自由基的抑制作用见图6。

图6 不同黄酮浓度对DPPH自由基的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of different flavonoid concentrations on DPPH·

由图6可以看出，柚子表皮黄酮类化合物浓度较小时，随着浓度的增加，对DPPH自由基抑制作用增强，当柚子表皮黄酮类化合物浓度达到0.000 387（mg/mL）时，对DPPH自由基抑制作用达到最佳，抑制率可达到97.55%，之后，随着柚子表皮黄酮类化合物浓度继续增加，对DPPH自由基抑制作用逐步降低。

3 结果与讨论

超声-微波协同萃取法提取，是利用超声波振动空化作用以及微波的高能作用，从而加速目标物从固相进入溶剂相，可在低温常压条件下进行提取，可有效保持柚子表皮黄酮类化合物生物活性，且整个提取过程与传统提取方法相比时间短，能耗低，绿色环保，无环境污染。

1）通过单因素试验，选择对提取率影响较大的因素及适当的水平做正交试验，确定超声微波协同萃取柚皮中总黄酮的最佳工艺条件为：提取时间为30 s、料液比为 1 ∶30（g/mL）、提取功率为 85 W、乙醇浓度为65%。在此条件下，经多次平行试验得出黄酮提得率平均值可达到0.34%。

2）对提取的总黄酮提取液进行不同梯度的稀释，测定不同黄酮浓度对DPPH自由基的抑制率。柚子表皮黄酮类化合物浓度较小时，随着浓度的增加，对DPPH自由基抑制作用增强，当柚子表皮黄酮类化合物浓度达到0.000 387（mg/mL）时，对DPPH自由基抑制作用达到最佳，抑制率可达到97.55%，之后，随着柚子表皮黄酮类化合物浓度继续增加，对DPPH自由基抑制作用逐步降低。

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