类风湿关节炎患者外周血Treg细胞及其分泌IL-35水平检测与临床意义

熊怡淞，宋 燕，俞 娟，陈 莉△

(1.成都军区总医院检验科，成都 610083；2南通大学附属医院检验科，江苏南通 226001)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫性疾病，以双手、腕、膝、踝和足关节的对称性多关节炎为主要表现，其病因及发病机制目前尚不明确[1]。研究发现CD4+T 细胞亚群失衡及各种细胞因子和炎症介质的异常表达在RA 发病中起重要作用；CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)具有免疫应答负调节和免疫无反应性两大功能，在RA发病和进展中起负调控作用[2]，而白细胞介素(IL)-35是Treg细胞发挥最大抑制效应所必需的一种抑制性细胞因子。 IL-35属于IL-12 细胞因子家族，主要由Treg细胞分泌。小鼠体内实验表明，体内IL-35 的表达缺失降低了Treg 细胞的抑制功能，与野生型Treg 相比，IL-35 缺陷的Treg 细胞不能控制效应T细胞的增殖[3]。目前国内对RA患者Treg细胞及其所分泌的IL-35的相关研究和报道较少，因此本研究拟观察RA患者外周血中Treg细胞和IL-35表达及其与临床指标的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2014年10月至2016年10月在成都军区总医院就诊并确诊为RA的患者45例(RA组)，均符合1987年美国风湿病学会诊断标准[4]。其中男9例，女36例，年龄22～78岁，部分患者经过抗风湿药物或激素治疗，根据28关节疾病活动度评分(DAS28)评估目前疾病活动程度：DAS28=0.56×(压痛关节数)1/2+0.28×(肿胀关节数)1/2+0.70×Ln[红细胞沉降率(ERS)]+0.014×(患者健康状况评分)。选择同时期骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者22例(OA组)，其中男8例，女14例，年龄38～69岁。选择同期健康体检者26例(对照组)，其中男8例，女18例，年龄17～65岁。本研究通过该院伦理委员会批准并已获得入选对象的知情同意。排除标准：合并其他自身免疫性疾病及高血压、糖尿病、冠心病、肿瘤性疾病、急慢性感染、传染性疾病，合并严重并发症，孕妇及哺乳期妇女。

A：根据前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)圈出淋巴细胞门LY；B：根据CD4表达圈出CD4+T细胞；C：RA患者CD4+T细胞中foxp3及CD25表达；D：OA患者CD4+T细胞中foxp3及CD25表达；E：健康者CD4+T细胞中foxp3及CD25表达

图1 FCM检测外周血Treg表达

1.2方法

1.2.1仪器与试剂 BD FACSCanto Ⅱ流式细胞检测仪购自美国BD公司；低速离心机(KDC-40 型)购自河北白洋离心机厂；酶标仪购自美国Bio-rad公司；洗板机405LS购自美国Biotek公司；CD4-FITC荧光单克隆抗体、CD25-PE荧光单克隆抗体、Foxp3-Alexa Fluor®647荧光单克隆抗体、破膜剂(BD Cytofix/Cytoperm)购自美国Becton Dickinson 公司；牛血清清蛋白(BSA)购自瑞士Roche公司；人IL-35细胞因子检测试剂盒购自美国MyBioSource公司；人淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2.2标本采集 采集各组对象空腹静脉外周血标本，用EDTA-K2抗凝处理，于8 h内分析检测，用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，PBS清洗重悬，制成浓度为1.0×107/mL细胞悬液用于流式细胞术(FCM)检测。全血标本3 000 r/min离心5 min分离血浆用于细胞因子检测。

1.2.3Treg细胞的检测 (1)取流式上样管，加入各6 μL的CD4和CD25单抗及100 μL PBMC悬液，混匀，室温避光放置20 min；(2)混匀细胞，加入250 μL BD Cytofix/Cytoperm，混匀，4 ℃放置20 min；(3)加入1 mL BD Perm/WashTMbuffer,1 500 r/min水平离心5 min，弃上清液，沾干；(4)重复第3步再洗1遍；(5)将细胞重悬于50 μL BD Perm/WashTMbuffer ，加入foxp3抗体10 μL，混匀，4 ℃放置30～60 min；(6)重复步骤3洗2遍，弃上清液，细胞重悬于500 μL PBS中，用BD FACSCanto ⅡFCM检测，Diva软件分析结果。

1.2.4IL-35的检测 用ELISA方法检测血浆IL-35水平，操作按试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.13组对象外周血中Treg细胞水平比较 FCM分析Treg表达，见图1。结果发现，RA组患者外周血中Treg(CD4+CD25+foxp3+T)细胞占CD4+T细胞百分率较对照组明显升高(P<0.05)；OA组患者Treg表达比RA患者高，但差异无统计学意义(P=0.086)。3组对象foxp3的荧光强度比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组对象Treg表达率及foxp3荧光强度的比较

a：P<0.05，与对照组比较

2.2RA患者不同组别外周血Treg细胞水平比较 根据DAS28评分将RA患者分成4组，DAS28评分越高的患者，其外周血Treg细胞数量和foxp3荧光强度越低，Treg百分数在各组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，而foxp3的荧光强度在各组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 RA患者不同DAS28评分Treg表达及foxp3荧光强度的比较

a：P<0.01，与小于2.6分比较；b：P<0.01，与2.6～<3.2分比较；c：P<0.01，与3.2～5.1分比较

2.3转录因子foxp3表达与CD25表达的相关性 将CD4+T细胞根据CD25表达荧光强度不同分为P3、P4、P5 3群，分别显示每群细胞foxp3表达情况(图2)。foxp3主要表达于高表达CD25的CD4+T细胞，中等程度表达CD25的细胞中也含有少量foxp3阳性细胞。可见foxp3表达与CD25表达呈正相关性。

2.43组对象IL-35水平比较 RA、OA、对照组血浆IL-35分别为(34.22±14.35)、(78.63±24.58)、(67.56±25.43)ng/L，RA组外周血中IL-35水平明显低于OA组及对照组(P<0.05)；IL-35在RA患者DAS28<2.6分、2.6～<3.2分、3.2～5.1分、>5.1分组分别为(50.53±16.44)、(42.93±13.53)、(7.97±4.52)、(2.70±1.74)ng/L，DAS28评分越高IL-35水平越低，各组间比较差异有统计学意义(F=30.725，P<0.01)，见图3。

2.5RA患者Treg数量与RA实验室指标相关性分析 相关性分析发现，RA患者Treg数量与类风湿因子(RF)、C反应蛋白、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体无相关性，而与ESR、DAS28评分呈负相关(r=-0.223、-0.343，P=0.023、0.011)。IL-35水平与DAS28评分呈负相关(r=-0.368，P=0.008)。

图2 foxp3表达与CD25表达的相关性

a：P<0.05，与RA组比较；b：P<0.01，与小于2.6分比较；c：P<0.01，与2.6～<3.2分比较；d：P<0.01，与3.2～5.1分比较

图3各组间IL-35水平比较

3 讨 论

目前RA病因和发病机制尚不完全清楚，但一般认为与机体的自身免疫耐受被打破有关[5]。Treg细胞是一群具有免疫负调控作用的T淋巴细胞亚群，健康人外周血Treg细胞占CD4+T细胞的5%～10%，其在维持机体自身免疫耐受方面发挥着极为重要的作用[6]。Treg细胞主要通过以下3个方面发挥免疫抑制作用：(1)细胞直接接触介导抑制;(2)分泌抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β、IL-2等；(3)表达抑制性转录因子foxp3[7-9]。

IL-35是IL-12家族成员之一，主要由Treg细胞产生。IL-35由P35亚基和EBI3亚基构成，其中P35亚基与IL-12 P35亚基相同，EBI3亚基与IL-27 EBI3亚基相同。小鼠体内实验表明，IL-35的表达缺失降低了Treg细胞的抑制功能[3]，与野生型Treg细胞相比，IL-35缺陷的Treg细胞不能控制效应T细胞的增殖。NIEDBALA等[10]证明，构建的EBI3-P35-Fc融合蛋白体外能促进CD4+CD25+Treg细胞增殖，抑制CD4+CD25-T细胞增殖，体外和体内均能抑制Th17细胞的分化，抑制IL-17分泌，增强干扰素γ(IFN-γ)的产生，改善胶原性关节炎(CIA)症状。IL-35对CD4+和CD8+T细胞有抑制功能，但仅局限于外周血成熟T细胞。IL-35能诱导CD4+CD39+CD25+T细胞产生IL-10，从而阻止CIA的发生和恶化[11-12]。

本研究发现，RA患者外周血Treg细胞数量增加，但IL-35却明显低于对照组，说明具有负向调控功能的IL-35在RA表达降低，免疫耐受遭到破坏。但Treg细胞数量却增加，有可能其处于免疫“无能”状态，功能与正常Treg细胞不一致，不能发挥有效的免疫负调控功能。由于本研究中部分RA患者经过治疗，不能反映原始的发病状态，因此通过DAS28评分对RA患者进一步分组研究，发现不同组别Treg和IL-35表达存在较大差异，DAS28评分越高，代表疾病活动度越大，其Treg细胞比例和IL-35表达均降低，说明在疾病活动期，外周血中的Treg细胞数量及功能均受一定程度的抑制，负调控能力减弱，机体处于免疫激活状态。而疾病恢复期Treg细胞数量和分泌IL-35功能均增强，甚至超过对照组，使机体处于免疫抑制状态。本研究还发现，Treg细胞与RA病程具有一定相关性，并与ERS和DAS28评分呈负相关，而与RF和C反应蛋白均无相关性。Treg细胞分泌IL-35的水平也与疾病活动度指标DAS28评分呈现负相关关系。

有文献报道RA患者外周血Treg细胞及IL-35减少，关节液中Treg细胞增加[13-16]。也有研究发现RA患者外周血Treg细胞数量与对照组相比无变化或增高[17-18]。造成这些研究结果差异的可能因素有：(1)RA患者的活动度及不同病程的影响，患者处于风湿病的活动期，其Treg细胞的表达可能降低，而处于非活动期的患者其Treg细胞的表达可能跟健康者相同或者高于健康者。(2)用药情况，某些患者用药物治疗后，能部分改善机体免疫功能，重建机体对自身抗原的免疫耐受，其中Treg细胞就是重要的负调控细胞，其表达可能会增加[19]。(3)本研究中RA患者Treg表达虽高于对照组，但其IL-35水平降低，说明其发挥正常的免疫抑制能力减弱，可能属于功能缺陷的Treg细胞。(4)实验样本群及抽样误差造成的影响。

综上所述，Treg细胞及其分泌的IL-35有可能是影响RA发生、发展的重要因素，目前，对于此方面的研究尚待进一步完善，若研究清楚这些将对RA的发病及治疗提供有力的理论依据。

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