钩藤碱对惊厥持续状态幼年大鼠血清SOD水平和海马组织TLR4表达的影响

王常普，蔡小平

1.濮阳市中医院，河南 濮阳 457001；2.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004

惊厥是儿科较常见的急症，好发于6个月～5岁儿童，惊厥反复发作或处于持续状态而未能有效治疗时，可造成进行性脑损伤，给家庭及社会带来沉重负担[1]。钩藤碱是钩藤的主要有效成分之一，化学结构属于吲哚类生物碱[2]，钩藤碱的药理作用广泛，具有降低血压、收缩外周血管、降低血管阻力、抗血小板聚集、镇静以及抗惊厥等作用[3]，但对惊厥性脑损伤是否有保护作用未见报道。本研究通过建立惊厥持续状态大鼠模型，观察惊厥并给药后大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)水平和海马Toll样受体4(TLR4)表达的动态变化，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 18日龄SD大鼠，SPF级，雄性，160只，体质量60～70 g，河南省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(豫)2015-0004，适应性饲养1周后进行实验。SPF级实验室由河南省中医药研究院实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK(豫)2012-0009。

1.2 实验试剂 钩藤碱(成都德思特生物技术有限公司)；匹鲁卡品、氯化锂(美国Sigma公司)；硫酸阿托品注射液(湖北科伦药业有限公司)；SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗TLR4多克隆抗体、SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 实验仪器 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；RM2245型病理切片机(德国徕卡公司)；GL-20B型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.4 分组与模型制备 SD幼年大鼠腹腔注射氯化锂(120 mg/kg)，18 h后腹腔注射阿托品(1 mg/kg)以拮抗匹鲁卡品外周胆碱能反应，30 min后腹腔注射匹鲁卡品(100 mg/kg)，观察并记录大鼠惊厥发作级别。0级：无发作迹象；1级：面部抽动；2级：点头、湿狗样抖动；3级：前肢阵挛抽搐；4级：全身强直伴后肢站立；5级：全身强直痉挛。惊厥发作4级以上且时间持续达30 min，惊厥缓解后状态良好的大鼠为合格大鼠模型[4]。模型复制成功大鼠随机分为模型组、钩藤碱低剂量组、钩藤碱中剂量组、钩藤碱高剂量组4组，每组32只，另取32只正常幼年大鼠作为正常组，各组再按时间点随机分为4 h、24 h、48 h和72 h 4个亚组，每个亚组8只。钩藤碱低、中、高剂量组于造模后分别给予钩藤碱[10、20、40 mg/(kg·d)]腹腔注射，每天1次，连用3天，正常组、模型组腹腔注射等体积生理盐水。

1.5 血清SOD测定 按照预定时间点用乌拉坦麻醉大鼠，腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，羟胺法测定血清SOD活性。

1.6 海马组织TLR4的表达测定 取大鼠脑组织后快速分离海马组织，4%多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋后切片，二甲苯脱蜡后乙醇水化，修复抗原，灭活内源性过氧化氢酶，正常山羊血清封闭，TLR4一抗孵育过夜，滴加生物素化二抗，37℃孵育，滴加SABC，孵育，DAB显色后复染，显微镜下观察并采集图像。用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统分析TLR4免疫反应阳性的平均光密度值(Mean Optical Density，MOD)。每张切片随机取3个视野分析，取其平均值。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0软件对结果进行统计分析，计量资料以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。

2 结果

2.1 各组大鼠血清SOD水平比较 见表1。模型组大鼠惊厥后4 h血清SOD活性降低，48 h达到峰值，4个时间点模型组大鼠血清SOD值均低于正常组(P＜0.01)。与模型组比较，钩藤碱各剂量组大鼠血清SOD活性均显著升高，以24 h、48 h和72 h时较明显(P＜0.05，P＜0.01)，钩藤碱各剂量组大鼠血清SOD活性随着钩藤碱剂量增大而增强，呈剂量依赖关系。

表1 各组大鼠血清SOD水平比较(±s) U/mL

表1 各组大鼠血清SOD水平比较(±s) U/mL

与正常组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

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2.2 各组大鼠海马组织TLR4表达比较 见表2。模型组大鼠惊厥后4 h海马组织TLR4的表达增加，48 h达到峰值，4个时间点模型组大鼠海马组织TLR4的表达均高于正常组(P＜0.01)。与模型组比较，钩藤碱各剂量组大鼠海马组织TLR4的表达均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，钩藤碱各剂量组大鼠海马组织TLR4的表达随着钩藤碱剂量增大而减少。

表2 各组大鼠海马组织TLR4表达比较(±s) 平均光密度值

表2 各组大鼠海马组织TLR4表达比较(±s) 平均光密度值

与正常组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别T L R 4的表达正常组模型组钩藤碱低剂量组钩藤碱中剂量组钩藤碱高剂量组n 8 8 8 8 8 4 h 0.1 2 4±0.0 2 6 0.2 4 1±0.0 4 3①0.1 9 3±0.0 3 1②0.1 6 6±0.0 2 9③0.1 4 6±0.0 2 4③2 4 h 0.1 3 1±0.0 2 4 0.3 2 7±0.0 4 6①0.2 4 2±0.0 4 1③0.1 8 9±0.0 3 3③0.1 5 5±0.0 2 5③4 8 h 0.1 2 8±0.0 2 5 0.4 7 3±0.0 5 8①0.3 4 4±0.0 4 7③0.2 1 2±0.0 3 8③0.1 6 9±0.0 2 8③7 2 h 0.1 2 9±0.0 2 6 0.4 0 6±0.0 6 9①0.2 8 1±0.0 5 4③0.1 7 2±0.0 2 8③0.1 5 0±0.0 2 6③

3 讨论

惊厥是儿科常见的急症，尤多见于婴幼儿，表现为突然的全身或局部肌群呈强直性和阵挛性抽搐，常伴有意识障碍，其在儿童时期的发生率较一般人群高5～10倍，发病率约为3%～5%。一次惊厥发作持续30min以上或反复多次发作且间歇期意识不恢复者称为惊厥持续状态，其中20%的患者为反复发作或持续状态。惊厥反复发作或持续状态会危及患者生命或产生严重的后遗症，影响智力发育和健康，因此及时控制惊厥发作对患儿生长发育具有积极的意义。

惊厥常导致机体代谢明显加强，能量消耗增加，氧供应不足，脑组织缺氧，产生大量的氧自由基。氧自由基不但可以通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化反应攻击脑细胞脂质膜，而且通过脂质氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤，导致细胞膜构型和结构的破坏[5]。SOD是机体清除体内氧自由基的重要酶之一，SOD活性的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力[6]。本研究显示，大鼠惊厥后4 h血清SOD活性开始降低，48 h达到最低值，至72 h时血清SOD活性仍低于正常大鼠。

TLR4是一种跨膜识别受体，分为细胞外、细胞膜和细胞内3部分，是TLRs家族中最复杂的成员，在中枢神经系统可表达于神经细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等。TLR4活化后，TIR结构域与下游接头分子Mal/TIRAP和TRAM/TRIF结合，主要通过TRIF和MyD88依赖的两条信号通路激活NF-κB，活化的NF-κB进入细胞核发挥转录调控作用，激活IL-1、IL-6、IL-8、TNF-β等细胞因子的表达[7]，诱导细胞凋亡。TLR4在惊厥小鼠的脑实质、海马组织、室管膜、微脉管系统和脉络丛等周围的神经细胞、星型胶质细胞、小胶质细胞均大量表达，抑制TLR4后惊厥发作程度减轻。本研究显示，大鼠惊厥后海马组织TLR4的表达增加，与临床报道一致[8]。

钩藤是我国常用中药材，对中枢神经、心血管和血液系统等具有广泛的药理作用，钩藤对中枢神经系统主要表现为镇静、抗癫痫、抗惊厥和对神经元的保护等。钩藤碱是钩藤的主要有效成分之一，毒性低，副作用较小，临床用于治疗高血压、哮喘、癫痫等疾病。本实验结果表明，钩藤碱能降低惊厥持续状态幼年大鼠血清SOD水平和海马组织TLR4的表达，且呈剂量依赖关系，这可能是钩藤碱镇静抗癫痫的作用机制之一。

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