狭叶薰衣草愈伤组织诱导及原生质体分离研究

于奇峰，文斌，杨佳利，李广宇，孙艳彬*

(1.佳木斯大学理学院，黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯大学 农业与环境生物技术研究所，黑龙江 佳木斯 154007)

狭叶薰衣草(Lavenderangustifolia)是唇形科薰衣草属多年生草本植物，原产于地中海西部。在医药﹑食品﹑精油制造等领域被广泛应用，是重要的化工原料，具有较高的经济价值[1-2]。目前我国栽种的薰衣草主要从国外引进，由于土壤、土质、气候等因素影响导致种子萌芽率较低，制约了薰衣草产业的快速发展，因此薰衣草的品种改良和育种优化工作迫在眉睫。因愈伤组织和原生质体的细胞全能性高，是理想的实验材料[3-5]，在植物品种改良和细胞生理学等研究中有广泛的应用[6-7]，故本研究通过探究不同浓度生长调节剂对诱导愈伤组织的影响，不同浓度酶液对细胞壁分解及原生质体产量的影响等方面，为优化薰衣草品种，提高东北寒地气候的适应性等后续育种提供工作基础。本课题旨在建立薰衣草育种体系，促进薰衣草产业发展，替代传统农作物种植，以推动东北地区农业模式向现代农业转型。

1 实验材料

1.1 实验药品

MS培养基、吲哚丁酸(IBA)、6-苄基嘌呤(6-BA)、吗啉乙磺酸(MES)、甘露醇、中性红染剂、萘乙酸(NAA) 、2, 4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。

1.2 实验方法

1.2.1 外植体处理方法

选取薰衣草幼嫩叶片为外植体，用自来水冲洗20min，然后在无菌环境下对外植体进行消毒处理：先用乙醇溶液(75%)进行表面消毒1min，无菌水冲洗5次后，用0.1%的升汞溶液灭菌，无菌水冲洗5次。

消毒处理后将外植体分成6组，每组50株外植体，分别给予3、4、5、6、7、8min的灭菌时间，外植体处理完成后移植于含6-BA(0.5mg/L)和NAA(0.1mg/L)的MS培养基上进行初代培养，每个组培瓶接种1个薰衣草外植体，18d后统计外植体存活率，确定最佳灭菌时间。前期实验结果表明，外植体的最佳灭菌时间为升汞处理7min。

1.2.2 愈伤组织诱导

薰衣草外植体经处理后将叶片剪切成大小为0.5cm×0.5cm的正方形，接种到含有不同浓度植物生长调节剂的诱导培养基上，每组处理移植10瓶，每个组培瓶内移植5个薰衣草外植体。观察并记录薰衣草愈伤组织的诱导情况，于接种25 d后计算薰衣草的出愈率。

1.3 原生质体分离

1.3.1 确定薰衣草愈伤组织的渗透压

配置不同浓度梯度的甘露醇溶液，分组编号后置于试管内，将经诱导后获得的薰衣草愈伤组织投入盛有不同浓度的甘露醇溶液的试管内，1min后显微镜观察愈伤组织的质壁分离情况以确定薰衣草愈伤组织的渗透压。前期实验结果表明，适于薰衣草原生质体，保持渗透压平衡的甘露醇浓度为0.6 mol/L。

1.3.2 原生质体分离及纯化

在无菌环境下将愈伤组织用无菌的镊子压碎至1mm大小，然后将准备好的试验材料以1∶10的比例放入装有酶解液的无菌三角瓶中，将三角瓶置于转速为60r/min的25℃恒温摇床中黑暗震荡酶解12h以游离原生质体。

酶解后获得的浊液需在无菌环境下，先经200目筛网过滤去掉渣质，然后低速离心机以800r/min的速度离心8min，弃上清液，下层沉淀为粗提的薰衣草原生质体。向粗提的薰衣草原生质体中加入CPW洗液(0.1%MES，0.05mol/L CaCl2·2H2O)后，重复离心3次，原生质体培养液(MS液体培养基，0.6mol/L甘露醇)洗涤一次，得到纯化后的原生质体。

1.3.3 原生质体的产量统计与活力测定

使用血球计数板统计纯化后的原生质体数，每组样品计数5次，所有数据均用SPSS 16.60处理，计算出每克细胞中原生质体数见公式(1, 2)。

P=N×10×1000

公式(1)

公式(2)

式中：P为每毫升悬浮液中的原生质体数(个/mL)；N为1个大方格内的原生质体数(0.1mm2)；Y为原生质体的产量(个/g)；V为原生质体悬浮液总体积(mL)；M为用于酶解的悬浮细胞鲜重(g)。

以染色排除法测定原生质体的细胞活力，将中性红染液与原生质体悬浮液混合染色，30s后显微镜观察染色情况，完好且有活力的原生质体呈现红色，每组样品以血球计数板统计5次，计算原生质体活力，见公式(3)。

公式(3)

式中：H为原生质体的活力(%)；L为染成红色的原生质体总数；T为观察到的原生质体总数。

2 结果分析

2.1 愈伤组织诱导结果

愈伤组织诱导结果表明：编号1、2、3、4、5、6、7和8，愈伤组织的出愈率分别为66%、54%、73%、71%、88%、83%、76%和77%，其中编号5的愈伤组织出愈率最高，编号2的愈伤组织出愈率最低。在6-BA的浓度不变的情况下，2,4-D的浓度从1.4mg/L增加至1.8mg/L，愈伤组织的出愈率增大，2,4-D浓度从1.8mg/L增加至2.0mg/L，愈伤组织的出愈率减小，可见生长调节剂在浓度较低时，对诱导形成愈伤组织起促进作用，生长调节剂在浓度较高时，对诱导愈伤组织形成起抑制作用，结果见表1。

表1 生长调节剂各组分浓度及愈伤组织出愈率

2.2 原生质体分离

表2 酶液浓度、原生质体产量及活力

原生质体分离结果表明：在果胶酶含量为0.5%的情况下，纤维素酶含量从1.6%增加至2.0%，原生质体的产量及活力随纤维素酶含量的增大而增加；在果胶酶含量为1.0%的情况下，纤维素酶含量从1.6%增加至1.8%，原生质体的产量及活力随纤维素酶含量的增大而增加，但纤维素酶含量从1.8%增加至2.0%时，反而使得原生质体的产量和活力均有所下降，这一现象表明酶液浓度高时，纤维素酶及果胶酶组成的混合酶液也同样会将原生质体酶解，使其失去细胞活力，结果见表2。

3 结论

本研究中适于薰衣草愈伤组织诱导培养基：MS培养基+2,4-D 1.8mg/L+6-BA 0.5mg/L，诱导出愈率为88%；适于薰衣草原生质体分离的酶液配比：纤维素酶 1.8%+果胶酶 0.5%，原生质体产量为1.180×105个，活力为78.05%。本实验获得了诱导薰衣草愈伤组织的条件以及建立了原生质体分离体系，为后续获得适应东北寒地气候的薰衣草品种的育种工作奠定基础。但本次实验只探讨了不同浓度生长调节剂对愈伤组织诱导的影响和不同浓度酶液组合对原生质体分离影响，其他因素是否对薰衣草愈伤组织诱导和原生质体分离产生影响尚需进一步研究。

[1]陈守良,等.中国经济植物志,北京:科学出版社,1961:1450.

[2]解成喜,王强,崔晓明. 薰衣草挥发油化学成分的GC-MS分析[J].新疆大学学报(自然科学版),2002(3).

[3]赵丽君,王雪芳,张金林,等.植物组织培养及其在草类植物中的研究和应用[J].草业科学,2011,28(6):1140-1148.

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[5]于晓玲,李春强,彭明.植物原生质体技术及其应用[J].中国农学通报,2009,25(8):22-26.

[6]何永云.现代育种技术在植物品种改良中的应用[J].南方农业,2016,10(12):248-249.

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