祖师麻凝胶膏剂皮肤刺激和过敏性实验研究

蔡香菊 马 骏 马 兰 王志晓 刘旭霞 沈 薇 石晓峰

1.甘肃中医药大学国家中医药管理局中医药科研三级实验室中药药理实验室，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省医学科学研究院药物研究所，甘肃 兰州 730050

祖师麻味辛、苦，性温，具有祛风除湿、活血止痛、舒筋活络、消肿等功效，主治风湿痹痛、四肢麻木、腰痛、跌打损伤、风湿性关节痛等症。目前，临床上应用的含有祖师麻的外用制剂为祖师麻膏药、祖师麻风湿膏和祖师麻关节止痛膏，前两者为传统黑膏药，后者为橡胶膏剂，这些膏剂由于具有载药量较小(0.2%～2.0%)、生物利用度低、对皮肤有刺激性、使用需要温热软化，贴敷于皮肤上不易揭去等缺点[1]，使其应用受到限制；而凝胶膏剂的载药量大，一般为5%～10% ，最大可达20%[2]，基质中透皮吸收促进剂、保湿剂、高分子亲水基质以及交联调节剂的使用，使其透皮吸收更好、生物利用度高，且对皮肤刺激小，可反复贴敷[3]，用于皮肤表面涂展性好，无油腻感，不污染衣物。因此，甘肃省医学科学研究院将以前的祖师麻膏剂通过剂型改变，选用合适的基质，自主研发制成了祖师麻凝胶膏剂，为使其安全进入临床观察，进行医院制剂的申报，同时也为临床使用提供可靠的科学依据，实验根据外用药皮肤实验的要求，进行了皮肤刺激性实验和过敏性实验，现将实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 祖师麻凝胶膏剂及基质，由甘肃省医学科学研究院提供；2,4-二硝基氯苯(批号：789204，天津市化学试剂一厂。使用时用丙酮配制成 1% 致敏浓度，0.1% 激发浓度)；硫化钠(批号：120311，天津市大茂化学试剂厂)；生石灰(批号：120916，上海中秦化学试剂有限公司)。1.2 实验动物 健康成年新西兰白家兔16只，雌雄各半，体重2.0～2.5 kg，合格证号：62000600000160，生产许可证号：SCXK(甘) 2015-0001。健康白色豚鼠，18只，雌雄各半，体重 300～400 g，合格证号：62000600000159，生产许可证号：SCXK (甘) 2015-0001。均由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物场提供。

1.3 方法

1.3.1 祖师麻凝胶膏剂的家兔皮肤刺激性实验 取16只家兔，给药24 h前先将背部脊柱左右两侧用剪毛剪剪出面积为3 cm×3 cm的区域，再用脱毛剂(硫化钠20g+生石灰30 g，用40%乙醇配成200 ml的溶液[4])将该区域脱毛，毛发软化之后用40℃温水洗去，再用纸巾擦干脱毛处皮肤即可，24 h后检查脱毛皮肤是否受伤，受伤的皮肤不能作完整皮肤的刺激性实验。将16只已脱毛家兔，随机分为两组，完整皮肤组和破损皮肤组各8只，破损皮肤组两侧脱毛皮肤用细砂纸摩擦造成局部擦伤，以擦伤表皮、不伤真皮、轻度渗血为度，两侧皮肤的破损程度应基本一致。将祖师麻凝胶膏剂和基质剪成3 cm×3 cm的小方块，两组给药均为左边基质、右边药物，将药物和基质贴上之后用医用胶布和纱布缠绕固定，保持药物与皮肤接触4 h后去除医用胶布和纱布，揭去药物和基质，然后以温水洗去残留药物，分别在0 h、24 h后观察皮肤刺激性情况。每天给药1次，连续7 d。末次给药后，观察去除药物后0 h、24 h、48h、72h用药部位的红斑和水肿情况，进行皮肤刺激实验反应评分和刺激强度评价[5-7]。

1.3.2 祖师麻凝胶膏剂的豚鼠皮肤过敏性实验 将18只豚鼠在给药24 h前背部右侧脱毛，脱毛方法同上，随机分为3组，第一组为阳性对照2,4-二硝基氯苯组，第二组为受试药物祖师麻凝胶膏剂组，第三组为基质对照组，每组6只。将1%的2,4-二硝基氯苯(用丙酮配制)0.2 mL滴加于3 cm×3 cm的滤纸上，滤纸贴于第一组右侧脱毛区，用1层玻璃纸和2层纱布覆盖，胶布与纱布固定；将祖师麻凝胶膏剂和基质剪成3 cm×3 cm的小方块，分别贴敷于第二组和第三组动物的右侧脱毛区，用医用胶布和纱布缠绕固定。给药后动物单笼饲养，保持药物与皮肤接触6 h后去除医用胶布和纱布，揭去滤纸、药物和基质，然后以温水洗去残留药物，分别在0 h、24 h后观察皮肤过敏性情况并评分。第7天和第14天用同样方式各重复给药1次并观察。第28天激发给药，用上述同样方法将相应药物分别贴在各组动物背部的左侧脱毛区，其中阳性对照组浓度改用0.1% 2,4-二硝基氯苯激发，基质对照组和受试药物祖师麻凝胶膏剂组同前，包裹固定6 h后去除药物即刻观察，并于24 h、48 h及72 h再次观察皮肤过敏反应情况并作评分[7-8]，同时密切观察动物是否出现有哮喘、站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应。

1.4 评分标准 根据中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则[6]，按表 1、表 2 评分标准计分并判断刺激强度。根据中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光过敏反应)研究的技术指导原则[8]，按表3、4 评分标准计分,按皮肤过敏反应程度评价各组豚鼠皮肤过敏反应分值。

表1 皮肤刺激反应评分标准

表3 皮肤过敏反应评分标准

表4 皮肤致敏性评价标准

2 结果

2.1 家兔皮肤刺激性实验 祖师麻凝胶膏剂及其基质对破损及完整皮肤连续用药7天，按照评分标准记录出现红斑和水肿分值，并进行刺激强度评价。皮肤刺激实验反应平均值=(红斑形成总分+水肿形成总分) /合计动物数[9]。皮肤完整组家兔多次给药皮肤刺激反应最高平均分值为0.25，说明祖师麻凝胶膏剂及其基质对完整皮肤无刺激性；皮肤破损组家兔在第3、5和6天，去除药物0h后皮肤刺激反应最高平均分值为0.5，皮肤刺激反应强度表现为轻度刺激性，但在去除药物24h后即可恢复。见表5、表6。

表5 前6天皮肤刺激反应实验结果 (n=8)

表6 第7天末次给药后皮肤刺激反应实验结果 (n=8)

2.2 豚鼠皮肤过敏性实验 按表3皮肤过敏性反应评分标准评价记录各组各时间的平均分值，反应平均分值=(红斑形成总分+水肿形成总分)/合计动物数[10]。同时还应密切观察动物是否有哮喘、站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应出现。根据实验组和对照组动物皮肤反应的差别，判断受试物对皮肤过敏反应的性质，并计算过敏反应发生率。过敏反应发生率(%)[11]=(有过敏反应动物例数/合计动物数)×100% ，根据过敏反应发生率判断受试物的过敏反应强度。阳性致敏组在去除药物72 h内有不同程度的红斑与水肿，反应平均值0.8～2.6，致敏率为100%。祖师麻凝胶膏剂及其基质在3次给药致敏过程中，皮肤过敏反应平均分值均为0；第28 d再次接触此药(激发)，即刻观察直至72 h 后，均无红斑或水肿反应，亦无哮喘、站立不稳等全身性过敏反应，反应平均值为0，致敏率为0。表明祖师麻凝胶膏剂经皮肤给药无致敏作用。见表7、表8。

表7 致敏阶段豚鼠皮肤过敏反应平均分值 (分)

表8 激发阶段豚鼠皮肤过敏实验结果

3 讨论

风湿性关节炎是急性或慢性结缔组织炎症的常见疾病之一，给患者正常生活带来极大的负面影响，病情可反复发作或累及心脏。其临床症状以关节、肌肉游走性酸痛为特征，受累关节多为肩、膝、踝、肘等大关节，多由一个关节转至另一关节，病变区域局部呈红肿、剧痛、灼热，也可多个关节同时发病。该病属中医痹证范畴，临床表现变化多端，病证复杂，“虚邪瘀”为其基本病机[12]。类风湿性关节炎是一种以多发性、对称性关节炎症为主，可引起肢体严重畸形的慢性全身性自身免疫性疾病，主要病理改变为关节滑膜慢性炎症、增生形成绒毛状突起，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，最终导致关节畸形和功能丧失。

祖师麻是临床治疗风湿性关节炎和类风湿性关节炎的有效药物，其提取物祖师麻甲素具有抗炎、镇痛等作用，在临床应用中具有独特的疗效优势。为提高载药量、增强保湿性、减少对皮肤的刺激性，甘肃省医学科学研究院结合临床实践经验，改变目前的祖师麻制剂的剂型，将其制成了祖师麻凝胶膏剂，“内病外治”[13]，直接贴敷于关节处，经皮给药。研究考察了祖师麻凝胶膏剂外用的安全性，结果显示，祖师麻凝胶膏剂对家兔完整皮肤无刺激性，对破损皮肤有轻度刺激性，但在去除药物24h后即可恢复，对豚鼠皮肤也未见过敏性反应，表明该制剂皮肤给药具有较好的安全性。

[1]李欣孺．浅谈橡胶膏剂、巴布剂、透皮贴剂的研究进展[J]．中国民族民间医药,2010,9(24) : 24-26．

[2]李希珍,张庆贺,董刚,等.祖师麻凝胶膏剂的制备工艺及含量测定[J]．特产研究,2015, (2) : 18-22．

[3]董礼,徐希明,余江南．中药凝胶膏剂研究概述[J]．中国药师,2011,14(1) : 129-132．

[4]文洁,俞励平,孙素兰,等. 冰辛软膏皮肤安全性的研究[J]．食品与药品,2005,7(10) : 41-43.

[5]杨晔,焦正花,张小华,等. 止痛膏抗炎镇痛和皮肤刺激性实验研究[J]. 西部中医药,2014,27(3):26-28.

[6]《中药、天然药物局部刺激性和溶血性-研究技术指导原则》课题研究组．中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则[S]．北京：国家食品药品监督管理局药品审评中心，2005:11-20.

[7]李彦林, 周云丰, 李琳,等. 平痤洗剂皮肤刺激和过敏性实验研究[J]. 中国中医药信息杂志, 2016, 23(2):56-58.

[8]《中药天然药物免疫毒性(过敏性、光过敏反应)研究的技术指导原则》课题研究组．中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光过敏反应)研究的技术指导原则[S]．北京：国家食品药品监督管理局药品审评中心,2005:11.

[9]李艳,艾儒棣,谭正怀,等. 复方苦蛇乳膏皮肤刺激性和过敏性实验研究[J]．成都中医药大学学报,2012,35(1) : 14-15．

[10]张美松,何新军,陈宇,等. 祛癜复色软膏对动物皮肤过敏性反应的实验研究[J]．浙江中医杂志,2013,48(6) : 410-411．

[11]李跟旺,刘效栓,焦正花,等. 消定膏皮肤刺激性及致敏性研究[J]. 中国现代中药,2013,15(07):560-562.

[12]陕大艳,陈启明,王娴默,等. 针灸治疗风湿性关节炎临床研究[J]．中医学报,2014,29(9) : 1387-1388．

[13]夏裕发,褚克丹,李煌,等. 治疗类风湿性关节炎的中药经皮给药制剂研究概况[J]．中医外治杂志,2012,21(1) : 44-46．