龙眼提取物对H2O2致PC12细胞损伤的保护作用

李红艳 倪雪娇 陈晓霞 贾思禹 宋 婷

1. 辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600；2.辽宁中医药大学中医脏象理论及应用国家教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110032

龙眼俗名桂圆，其假种皮龙眼肉具有补益心脾、养血安神[1]等功效，并有改善记忆[2]、抗氧化[3]等作用。目前龙眼中仅龙眼肉作为药用部位，对龙眼壳、核等并无有效的开发利用。据报道，龙眼壳、核具有抗氧化、抗肿瘤[4-7]等作用，实验者认为其大量废弃不仅给炮制加工带来不便，同时造成了资源的浪费与环境的污染。本研究拟通过探讨龙眼不同提取物的神经保护作用，为龙眼的炮制加工及扩大应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 龙眼购自大连金鸿润食品发展有限公司，经王添敏副教授鉴定为无患子科植物龙眼(DimocarpuslonganLour.)的干燥成熟果实；PC12细胞(高分化)，辽宁中医药大学药理实验室提供；DMEM高糖培养基(Gibco)；胰蛋白酶、双抗、Annexin V-FITC/PI双染试剂盒均购自Genview；NU-4750型二氧化碳培养箱(Nuaire)。

1.2 方法

1.2.1 龙眼不同部位的制备 干燥龙眼，分离肉、壳、核，分别称重、粉碎，各取100.00 g，按1∶12(m∶v)加入去离子水微沸提取1 h，提取3次，合并滤液，60℃减压浓缩成浸膏，即得龙眼肉、龙眼壳、龙眼核提取物，以下简称龙眼肉、壳、核。

1.2.2 龙眼肉不同极性提取物的制备 精密称取龙眼肉100.00 g，同上煎煮，向滤液中加入乙酸乙酯反复萃取至上层液体无色，收集合并上层溶液，得乙酸乙酯提取物；下层加入正丁醇反复萃取至上层无色，收集上、下层溶液，分别得正丁醇提取物和水提取物。60 ℃减压浓缩成浸膏。

1.2.3 MTT法检测细胞存活 取对数生长期的PC12细胞，以105/mL接种于96孔板， 待细胞贴壁后，随机分为正常组、模型组和给药组，每组3个复孔。除正常组外，各组细胞用200 μM H2O2处理12 h，给药组于造模12 h后加入不同浓度的受试药物(最小浓度分别是各提取物的最低有效浓度)。继续培养12 h后，采用MTT法于酶标仪490 nm处测定各孔吸光度(A)值，计算细胞存活率，实验平行重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取生长状态良好的PC12细胞，铺于6 cm培养皿中，随机分为正常组、模型组和龙眼肉组(乙酸乙酯提取物1.6 mg/mL)。除正常组外，其余各组加入200 μM H2O2孵育12h，龙眼肉组于造模前加药预处理2 h，流式细胞仪检测细胞凋亡，每组3个复孔。

1.2.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计。组间比较采用单因素方差分析和t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 龙眼不同部位对细胞增殖的影响 显微镜观察可见，正常组细胞贴壁良好，轴突明显；模型组细胞形态不规整，突起肿胀破裂，有脱壁漂浮现象；给药组细胞形态趋于正常，突起损伤减轻，结构较完整。各组代表性图片如图1A所示。MTT检测结果表明，细胞存活率模型组较正常组下降；龙眼肉、壳、核组较模型组升高(P<0.05，P<0.01，图2B-D)，三者平均细胞存活率无统计学差异(P>0.05)，但浓度相差悬殊(图2E)。综合评价，笔者认为龙眼肉提取物的神经保护作用最强。

2.2 龙眼肉不同极性提取物对细胞增殖的影响 不同极性提取物均有神经保护作用(图2A-C)；相同浓度下，乙酸乙酯提取物促进增殖最明显(图2D)。如图2所示。

2.3 龙眼肉乙酸乙酯提取物对细胞凋亡的影响 模型组较正常组活细胞数减少，凋亡及坏死细胞数增加(P<0.05，P<0.01，图3D-G)；龙眼肉组即龙眼肉乙酸乙酯提取物较模型组活细胞数增加，中晚期凋亡及坏死细胞减少(P<0.05，图3D、F、G)，早期凋亡细胞无统计学差异(P>0.05)，但有降低趋势(图3E)。如图3所示，

3 讨论

本论研究用H2O2诱导细胞损伤，并采用龙眼提取物进行预处理或治疗，结果表明，龙眼肉、壳、核提取物，均能提高受损细胞存活率，且以龙眼肉用量最小，龙眼壳促进增殖作用最显著。综合考虑三者的量效差异，认为龙眼肉作用效果最好；同时，龙眼中壳、核所占比重不小，二者有很强的作用，如果一并入药，可减少炮制加工，并扩大了龙眼的药用来源。另外，根据细胞凋亡检测结果推测，抑制中晚期细胞凋亡与坏死是龙眼神经保护作用的可能机制，值得进一步深入研究。

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