美洲大蠊提取液调控大鼠难愈合创面微丝、桥粒实验研究

曾娟妮 杨 敏 刘 筱 李文华 周雯婷

1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410208； 2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410005

慢性难愈合创面因虚感邪，邪气致瘀，经久不愈，损其正气，正虚邪盛，不能托毒外出，瘀阻伤正，正损致腐，最终形成虚、邪、瘀、腐相互作用、互为因果的变化，其中虚是受邪的条件及血瘀伤正的结果。中医学对难愈合创面的认识有着悠久的历史，数千年来，历代医家不断总结治疗经验，积累了煨脓长肉、祛腐生肌、活血化瘀等丰富的治疗方法，但是由于中药复方药物成分复杂，具有多靶点、多途径等特点，给研究带来一定难度，其促愈机制目前探索不明。中医药治疗慢性难愈合创面因其疗效佳、费用低等特点，深受广大医生及患者欢迎。美洲大蠊提取液，具有通利血脉、散瘀活血、养阴生肌的作用，包含着中医扶正驱邪相辅相成的治疗法则，被广泛应用在创面修复、胃溃疡、肿瘤等领域[1-2]。笔者前期将美洲大蠊提取物外用于难愈合创面，取得满意疗效[3-4]，同时采用PCR、免疫组化等方法发现美洲大蠊提取液在肉芽生长期上调VEGF及TGF表达加速创面愈合，但促愈机制有待于进一步探讨。本实验应用日立 H7700透射电镜(10000倍),观察难愈合创面愈合过程中不同时间点伤口基底细胞的超微结构(微丝、桥粒)，进一步验证美洲大蠊提取液促进慢性难愈合创面修复的作用优势,为临床推广应用美洲大蠊提取液防治慢性难愈合创面提供一种可靠的治疗方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 动物 健康成年SPF 级 Wistar 雄性大鼠40只(NO.43004700026384)，12 周龄，体重 220g～250g，适应性喂养 1 周。

1.1.2 药材 美洲大蠊提取液组所敷纱条用美洲大蠊提取液(康复新，国药准字Z43020995，湖南中南科伦药业有限公司)。贝复济组所敷纱条用贝复济(国药准字S10980075，珠海亿胜生物制药有限公司)。

1.2 方法1.2.1 造模 参照付小兵等[5]全层皮肤缺损法经改进制成大鼠慢性难愈合创面模型。将40只大鼠随机分为：空白组(急性全层皮肤缺损组)10只、对照组(慢性难愈合创面组) 30只。空白组大鼠根据模型建立方法在造模区行全层皮肤切除，但不注射氢化可的松；慢性难愈合创面组大鼠在造模区行全层皮肤切除后立即注射氢化可的松，制备慢性难愈合创面模型，造模成功后随机分为模型组10只、美洲大蠊提取液组10只和贝复济组10只，各组创面制备后即开始药物干预，并每天换药1次。

1.2.2 给药 ①美洲大蠊提取液组：创面外敷两层美洲大蠊提取液纱条(0.2 mL/cm2)，按创面大小剪成小块贴于创面上，再加盖两层消毒干纱布，胶布固定。②贝复济组：创面外敷两层贝复济浸透纱布(60U/cm2)，按创面大小剪成小块贴于创面上，再加盖两层消毒干纱布，胶布固定。③模型组：创面外敷两层生理盐水纱布，按创面大小剪成小块贴于创面上，加盖两层消毒干纱布，胶布固定。④空白组：备皮处外敷两层生理盐水纱布，按备皮面积大小剪成小块贴于备皮处，加盖两层消毒干纱布，胶布固定，不作其他干预。

1.2.3 取材 模型制备完成后，各组于 7 d、15 d共 2个时间点在4组分别随机取 4只大鼠用 20%乌拉坦 5 mL/kg 腹腔注射麻醉后，取造模区创面组织，空白组取备皮处的相应部位全层皮肤，深达筋膜层。所取组织样品在 4℃ PBS 清洗，投入 2.5%电镜级戊二醛固定液，备透射电镜观察。 1.2.4 电镜观察 ①取材：组织块约 1×1×3 mm3。②制片：首先2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定 2 h以上。用 0.1M磷酸漂洗液漂洗 3 次，每次 10～15 min，1%锇酸固定液固定 1～2 h。用 0.1 M磷酸漂洗液漂洗 3 次，每次10～15 min。再脱水：50 %丙酮10～15 min ；70%丙酮 10～15 min；90 %丙酮 10～15 min；100%丙酮 15～20 min，中间更换一次。再浸泡、包埋：纯丙酮+包埋液(1∶1)37℃ 12 h；纯包埋液 37 ℃ 10～12 h。最后固化：37度烘箱内过夜，60 ℃烘箱内12～24 h。 超薄切片机切片 50～100 nm。③3 %醋酸铀以及硝酸铅双染色。④日立 H7700透射电镜观察、拍片。图像采集均由中南大学湘雅医院电镜室代为完成。观察各组伤口愈合处基底细胞的显微形态。

1.2.5 桥粒定量分析 角质形成细胞之间借助桥粒互相连接，电镜下可见中央层和附着斑，其上有张力微丝附着，桥粒的主要作用是维持细胞间的连接，能阻止溶液中的分子，特别是大分子沿着细胞间的缝隙渗入体内，维持细胞一个稳定的内环境。美洲大蠊提取物组在难愈合创面上促进伤口愈合优势，研究组特意选取创面细胞中的桥粒作为观察指标。创面肉芽组织选取第3、7、15天时4组标本各6例。桥粒定量采取10000倍下透射电镜下观察计算桥粒面积。

1.3 统计方法 采用统计学软件 SPSS 18.0 进行统计学分析，计量资料以均数加减标准差表示，两样本间比较采用t检验，多样本间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微丝、桥粒等超微结构 4组标本微丝、桥粒等超微结构，美州大蠊提取液组显示最佳，贝复济组次之，空白组更次，模型组最少。如图1、图2所示。

2.2 桥粒面积 应用透射电子显微镜，对24例标本桥粒面积统计，换药第3、7、15天时，美洲大蠊提取液组、贝复济组与空白组桥粒表达水平均明显高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 透射显微镜观察比较各组不同时期的桥粒面积表达水平 (nm,10000x)

注：与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

3.1 微丝、桥粒结构形态比较 美洲大蠊提取液组与其他组别比较，微丝密集，紧致，与空白组及模型组有差异；美洲大蠊提取液组创面新生细胞之间存在电子密度稍高的桥粒，与模型组及空白组比较有差异。表明美洲大蠊提取液加速创面新生细胞超微结构的形成，从而维持一个正常稳定的细胞内环境。

3.2 桥粒结构量化分析 正常新生细胞之间桥粒连接约20～25 nm，治疗第15天时，美洲大蠊提取液作用下的创面细胞间的桥粒面积为(25.7±1.53) nm，连接结构近乎正常细胞间面积，贝复济组桥粒面积为(23.3±2.06) nm，两者差异不具有统计学意义(P>0.05)，与其他各组间差异性大，且随着创面愈合时间越长，美洲大蠊提取液组与模型组及空白组之间差异越来越大，进一步表明桥粒的形成成功阻止溶液中大分子沿着细胞间的缝隙渗入体内，维持细胞一个稳定的内环境从而加速创面愈合。

创面的愈合涉及炎症反应、白细胞、成纤维细胞、内皮细胞及上皮角质细胞等多种细胞的迁移、增殖和分化，细胞生长因子分泌，基质沉积等[6-7]，难愈合创面细胞的超微结构是潜在的创面愈合生长标志物，微丝(microfilament)是细胞运动的结构基础，参与细胞分裂时收缩环形成，桥粒(bridge granule)多见于上皮，尤以复层扁平上皮细胞间较多，桥粒上有张力微丝附着，张力微丝是角蛋白的前身，它对保持细胞形态起重要作用，故桥粒对新生细胞的形态维持起重要作用。实验结果提示美洲大蠊提取物对难愈合创面新生细胞的形成有着绝对优势，也进一步证明美洲大蠊提取物通过增加微丝及桥粒的数量加速细胞分裂，加速肌肉收缩,使微绒毛,应变纤维，胞质环流以及加速细胞间连接，阻止溶液中大分子沿着细胞间的缝隙渗入体内，维持细胞一个稳定的内环境从而加速创面愈合。

[1]尹彬. 康复新联合奥美拉唑、阿莫西林胶囊三联疗法治疗消化性溃疡疗效分析[J].中外医学研究，2010, 8(26)：17-18.

[2]刘宏宇. 保留灌肠治疗放射性直肠炎48例疗效观察[J] . 中国医学创新，2010，7(3)：29-29.

[3]伍伟明，金丽颖，王真权，等. 康复新液治疗肛管难愈合创面的临床研究[J].中医药导报，2015,21(22)：71-73.

[4]曾娟妮，刘筱，伍伟明，等. 美洲大蠊提取液对大鼠难愈合创面VEGF表达影响的研究[J].中国民族民间医药，2016,25(19):64-66.

[5]付小兵，孙同柱，盛志勇. 几种用于创伤修复研究的动物模型[J].中华实验外科杂志，1999,16(5):479-480.

[6]Bauer SM, Bauer RJ,Velazquez OC. Angiogenesis vasculogenesis and induction of healing in chronic wounds [J]. Vasc Endovasc Surg,2005,39(4)：293-306.

[7]Brusselaers N, Pirayesh A, Hoeksema H, et al. Serum replacement in burns [J]. J Trauma, 2010, 68(2): 490-501.