PAP动态监测血浆cfDNA在进展期非小细胞肺癌患者治疗中的应用*

徐晓燕 阎昭 王雨萌 孟昭婷 陈金良 王青山 林丽 苏雨栋 丁少峰 朱琳 陈鹏

肺癌是我国及世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤［1］，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%～85%。以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR－TKIs）为代表的靶向药物是晚期NSCLC的重要治疗方式，EGFR突变是EGFR-TKIs治疗的重要靶点和关键性预测标志物。肺癌晚期患者居多，手术机会少，突变的组织受检率低。血液中循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）可以反映肿瘤原发部位的基因改变［2-4］，利用cfDNA进行EGFR突变检测具有简便、快捷、微创等独特优势，加之cfDNA半衰期短［5］，实时反映肿瘤的突变状态，使动态监测成为可能。目前对于cfDNA的研究以及指导临床的数据并不多，cfDNA的检测方法尚缺乏统一标准。焦磷酸化激活聚合反应（pyrophosphorolysis-activated polymerization，PAP）是一种原创性核酸扩增技术，通过封闭性引物定向串联焦磷酸化反应和聚合反应而具有超高灵敏度和特异度［6］。本研究主要探讨PAP动态监测血浆cfDNA在进展期非小细胞肺癌患者治疗中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2016年3月至2017年6月天津医科大学肿瘤医院就诊的进展期NSCLC患者85例，其中男性47例（55.3%），女性38例（44.7%），年龄32～80岁，中位年龄62岁。ⅢA期4例（4.7%），ⅢB期4例（4.7%），Ⅳ期77例（90.6%）。腺癌78例（91.8%），腺鳞癌3例（3.4%），大细胞癌2例（2.4%），肉瘤样癌2例（2.4%）。NSCLC诊断标准依据卫生部《原发性肺癌诊疗规范（2015年版）》。对85例患者，进行血浆cfDNA EGFR突变检测，对突变阳性的38例患者进行连续血浆检测（每2个月1次）。本研究通过天津医科大学肿瘤医院伦理委员会审批，所有受试者入组前均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本 常规方法静脉采集10 mL全血样本，于2 h内使用人血浆游离核酸提取试剂盒（天津精耐特基因生物技术有限公司）分离提取cfDNA，使用基于PAP核酸扩增实时荧光PCR法的EGFR基因突变检测试剂盒（天津精耐特基因生物技术有限公司）对EGFR的特定变异类型19Del、L858R和T790M进行检测。首次检测同时使用首个获得国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准用于血液EGFR特定突变检测的基于扩增阻滞突变系统（amplication refractory mutation system，ARMS）实时荧光PCR法的EGFR基因突变检测试剂盒（厦门艾德生物医药科技有限公司）对比验证。血浆样本采集、运送、保存、检测标准依据CFDA制定的《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》及试剂盒说明书要求。

1.2.2 收集与随访 患者临床病理特征及组织基因突变信息均来自天津医科大学肿瘤医院病历与检测报告，组织EGFR突变检测方法为传统Sanger测序法。采用面访、电话及病历查阅方式对患者进行随访，患者疗效评价标准依据RECIST 1.1版。随访截至2017年7月30日，随访时间4～12个月，中位随访时间为8个月，随访率100%。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。血浆与组织样本基因突变检测结果及两种检测方法对血浆基因突变检测结果的差异性分析采用McNemar检验，组间率的比较及临床病理特征的分析采用χ2检验，在样本数量过少时使用Fisher test检验，检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 血浆与组织EGFR突变检测结果比较

对其中已有组织检测结果的42例进行血浆与组织EGFR突变状况比较，一致性69.0%（29/42），灵敏度47.4%（9/19），特异度87.0%（20/23），阳性预测值75.0%（9/12），阴性预测值66.7%（20/30）；McNemar检验认为两样本检测结果一致（P=0.092）。血浆与组织EGFR突变状况比较见表1。

表1 血浆与组织EGFR突变状况比较 （n=42）

2.2 PAP与ARMS-PCR检测血浆EGFR突变状况比较

对85例PAP与ARMS-PCR检测血浆EGFR突变结果比较，一致性81.2%（69/85），灵敏度56%（14/25），特异度91.7%（55/60），阳性预测值73.7%（14/19），阴性预测值83.3%（55/66）；McNemar检验认为两种方法检测结果一致（P=0.210）。PAP与ARMS PCR检测血浆EGFR突变状况的一致性见表2。

表2 PAP与ARMS-PCR检测血浆EGFR突变状况的一致性（n=85）

2.3 血浆EGFR突变状况与临床病理特征的关系

85例患者中EGFR突变状况，与年龄、吸烟情况、肿瘤家族史、体力状态评分、病理类型及疾病分期无显著相关性，仅与性别相关。血浆EGFR突变发生率女性较男性高［65.0%（13/20）vs.75.0%（7/20），P＜0.05］，差异具有统计学意义。血浆EGFR突变状况与临床病理特征的关系见表3。

2.4 血浆EGFR突变动态监测与临床诊治的关系

对组织或血浆EGFR突变阳性的38例患者进行每2个月1次外周血基因突变动态检测，共得到113份不同时期血浆样本，同前次血浆EGFR突变状况比较，动态监测结果为突变型（突变型→突变型，野生型→突变型）或野生型（突变型→野生型，野生型→野生型）；收集相应时间范围临床资料进行统计学分析，突变变化情况与患者TNM分期（P=0.179）、治疗方法（P=0.885）无关；与疾病进展情况（P＜0.001）有关。疾病进展时血浆检测结果突变型62.5%（15/24），疾病稳定或缓解时血浆检测结果突变型21.3%（19/89），差异具有统计学意义。血浆EGFR突变动态监测与临床诊治的关系见表4。

表3 血浆EGFR突变状况与临床病理特征的关系 （n=85）

表4 血浆EGFR突变动态监测与诊治的关系

3 讨论

cfDNA是血液中被降解的DNA片段，其中来源于肿瘤细胞的被称作循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。cfDNA反映原发或转移部位肿瘤的基因变化情况，被认为可代替组织标本进行突变检测。在EGFR基因突变检测中，如果组织标本不足或难以获得，血液是合适的替代生物材料［7］。简便、快捷、微创的非侵入性获得方式，以及在术后患者、晚期患者、EGFR-TKIs治疗患者的基因检测方面克服的术后再活检组织不足、肿瘤异质性、重复多次等问题，使血液检测表现出组织检测不可比拟的优势。

目前尚缺乏cfDNA标本采集处理和分析检测的统一标准。普遍认为需使用EDTA抗凝管采血，保证采血到实验室处理间隔时间在4 h以内，血浆检测优于血清［8］。Wang等［9］认为ctDNA的释放可能存在时间特异性，但同一天不同时间点采血对基因检测结果没有影响。本研究采用EDTA抗凝管，受试者清晨采血，血液采集到实验室处理间隔时间在2 h以内。分离血浆标本提取cfDNA，采用PAP检测突变。焦磷酸化反应是脱氧核糖核酸聚合反应的逆反应，3'末端阻断性引物（封闭性引物）因带有3'末端非延伸性核苷酸（3'末端阻断剂）不能被直接延伸，在焦磷酸化反应去除阻断剂后被聚合酶延伸，PAP定向串连焦磷酸化反应和聚合反应，具有很高的灵敏度和特异度，能从掺杂的十亿个几乎完全相同的核酸分子中特异地扩增出一个拷贝的核酸分子，这种水平的选择性比现有的PCR技术高出一百万倍以上［6］。

PAP对血浆cfDNA的检测结果，与组织检测结果及ARMS-PCR血浆检测结果比较均无显著性差异，提示PAP可以用于检测血浆cfDNA突变。血浆与组织EGFR突变检测结果存在一致性［10-11］，Reck等［12］的血浆和组织EGFR突变检测，一致性为89%，敏感度46%，特异度97%，阳性预测值78%，阴性预测值90%。本研究数据较之偏低，42例中存在13例血浆和组织检测结果不符，可能与采样间隔时间较长而受到肿瘤异质性影响有关，13例患者组织检测标本均为确诊时手术标本或活检组织，血浆样本采集时间则在化疗1个周期后或服用EGFR-TKIs后。肿瘤存在转移灶和原发灶之间的空间特异性，不同阶段不同疾病状态的时间特异性，cfDNA的动态检测被认为可以克服异质性难题，实现实时监测、早期发现获得性耐药等［13］。PAP与ARMS-PCR均可被应用于cfDNA的动态检测，但PAP采用特殊封闭性引物产生的灵敏度和特异性较ARMS-PCR更高，且价格更为低廉，对于需要进行多次血浆检测的患者可能更为适用。

目前普遍认为EGFR突变的优势人群是亚裔、年轻、女性、不吸烟、腺癌患者［14］。本研究检测血浆EGFR突变状态，发现突变发生率仅与性别相关。差异可能源于检测标本的不同，即组织与血浆突变的优势人群可能有所差异。Wang等［15］研究发现对于二线或多线使用靶向治疗者，实时血浆检测突变阳性，不考虑组织检测结果（B+/T-和B+/T+）者，较血浆检测阴性者（B-/T+）PFS长（P=0.044）。提示二线或多线接受靶向治疗者，血检具有重要价值，尤其是对于组织EGFR突变的非优势人群。

对于38例患者cfDNA动态检测发现，突变变化情况与患者TNM分期及治疗方法无关，与疾病进展情况有关。cfDNA主要来自肿瘤细胞的坏死和凋亡，分期越晚、肿瘤内EGFR突变负荷越大，cfDNA含量越多，血浆基因检测越容易得到阳性结果；但研究也证实肿瘤内EGFR突变负荷越大，患者对EGFR-TKIs治疗效果越好［16］。本研究发现治疗效果较好即疾病稳定时，血浆突变检出率较低，认为治疗前血检突变情况可能会与疾病分期相关，但治疗过程中实时血浆检测突变情况与分期无关。

研究结果显示血浆基因突变变化情况与治疗手段本身无显著相关性，而与疗效相关。观察到9例血浆突变阳性的患者在接受化疗后突变消失，这基于疾病缓解或稳定，因为疾病进展时突变又再次出现。Zhang等［17］也曾对治疗前后患者血浆基因突变状态比较，发现突变情况不受化疗影响（P＞0.05），但受靶向治疗影响（P＜0.05）。Guo等［18］对早期患者手术前后cfDNA检测对比发现，手术后cfDNA水平较之前增高，但突变频率降低，认为手术伤口导致了正常细胞过多释放cfDNA，但突变频率不受cfDNA总量的影响。本研究中治疗方式为手术者为术后复发行血浆基因检测，考虑存在疾病复发肿瘤负荷增加因素，未得到手术后突变检出率低的结果。若突变状况与治疗方法无关，仅与疾病进展情况有关，则cfDNA实时监测可广泛用于突变患者的疗效评价而不局限于接受靶向治疗者。

疾病进展时较稳定或缓解时血浆基因突变检出率高，考虑与疾病进展肿瘤负荷增加及时间特异性有关。提示在动态监测过程中，血浆检测结果由阴性变为阳性或持续阳性，疾病进展可能性大。血浆检测结果阴性者考虑为治疗有效，cfDNA水平低不易检出。在疾病进展患者中，本研究不仅观察到血浆检测突变呈阳性，更有6例突变出现早于影像学评估，这又提示cfDNA的动态检测不仅能够帮助判断疗效，更能早期发现疾病进展。

本研究观察到9例患者在EGFR-TKIs治疗过程中血浆检测出现T790M突变，其中1例接受化疗6个周期，疗效评价稳定，血检突变消失，6个月后疾病进展，血检突变再次出现，接受奥希替尼治疗后，疾病稳定，血检突变再次消失；另有6例出现T790M突变后随即接受奥希替尼治疗；疾病控制率71.4%（5/7）。1例接受化疗，疗效评价稳定，动态血浆监测仍在进行当中；1例暂继续服用易瑞沙治疗。Xu等［19］的研究中观察到2例19Del突变患者在靶向治疗2年后血浆检测出现19Del和T790M双突变，早于疾病恶化5个月。Jinfeng等［20］对120例服用EGFR-TKIs的患者进行了连续5次（每2个月1次）血浆突变检测，49%的患者出现T790M突变并预后不良。Soria等［21］的研究则发现患者获得性耐药后，靶向药物联合化疗相比于单纯化疗并不能延长患者生存期，而实时血浆T790M检测对下一步治疗具有重要的指导意义。

de Las Casas等［22］报道了1例动态监测cfDNA突变的病例。组织检测L858R突变患者，靶向治疗16个月后cfDNA突变检测结果为L858R及T790M突变，化疗后疗效评价为部分缓解，血浆检测显示L858R及T790M突变消失。半年后再一次血浆检测呈L858R及T790M突变，随后影像学证实疾病进展。提示cfDNA动态监测能早期发现疾病进展、评价疗效，基因突变水平升高提示疾病进展，治疗有效时突变水平下降或突变消失，与本研究结果相符。

本研究样本量较少，持续时间较短，血浆EGFR基因突变动态变化与临床疗效关系分析仅局限于近期疗效方面；使用的检测技术仅对cfDNA基因突变进行了定性分析，定量水平分析可能会对本研究结果补充支持，抑或有新的发现。

血浆cfDNA比例低、半衰期短，高度片段化，检测cfDNA突变的方法必须具有高度灵敏性和特异性。封闭性引物的双向选择性在理论上决定了PAP拥有超高的灵敏度和特异度。这一方法检测cfNDA与ARMS法检测及组织检测结果一致，表明PAP在cfNDA检测中具有极大的临床应用前景。PAP动态监测NSCLC血浆cfDNA突变状况，能够预测靶向治疗的疗效，对继发的T790M突变具有诊断价值。而化疗后敏感突变及耐药T790M突变的消失则提示动态检测对于化疗亦有很好的预测疗效价值。夏国豪等［23］研究发现EGFR-TKIs治疗晚期NSCLC长期获益后获得性耐药的患者，先化疗、后再次应用EGFR-TKIs，大部分患者仍能取得一定疗效。对于这些需要化疗以及靶向药物交替治疗的患者，cfDNA的动态监测是一项有价值的疗效评价手段，能够帮助更精确的选择治疗方案。

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