外周血粒淋比联合肿瘤相关中性粒细胞对术后胃癌患者预后的影响*

黄晓培 朱江波 常文军 张晓芳 张天宝 康争春 薛伟

胃癌是中国常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率在恶性肿瘤中居第3位［1］。近年来，随着诊断治疗水平的提高及人们饮食习惯的改变，胃癌的发病率、病死率有下降的趋势。但由于存在复发和转移，胃癌患者的预后仍然较差。准确地评估胃癌患者的预后并对预后较差的患者施以辅助化疗、免疫治疗等方法，可极大地改善患者的预后。目前TNM分期是最重要的评估胃癌预后的方法，但即使同一TNM分期的患者，预后仍然存在较大的差别。因此，亟待找到一种新的评价体系更好地评估胃癌患者的预后。

近年来，外周血中性粒细胞与淋巴细胞的比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）和恶性肿瘤预后的相关性成为研究者关注的热点，目前已证实NLR与胃癌、结肠癌、肝细胞癌等恶性肿瘤的预后密切相关［2-4］。但其灵敏性、特异性均较差，暂未应用于临床作为预测胃癌预后的重要指标。肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TANs）作为肿瘤微环境的重要成员，也已证实与胃癌的预后密切相关［5］。上述研究仅是单一地分析血液或肿瘤组织中中性粒细胞对胃癌预后的影响，并不能反映中性粒细胞对胃癌的综合影响，因而对胃癌患者预后的判断存在较大的限制。本研究旨在探讨外周血NLR联合肿瘤组织TANs浸润对预后的预测价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料

随机选取第二军医大学附属长海医院2006年6月至2011年5月收治的180例胃癌患者，所有患者均行手术切除术。将其中随访资料完整、术前均未行放化疗及其他抗肿瘤治疗，且自身未患免疫系统相关疾病的126例胃癌患者纳入研究。胃癌患者的统计学资料及临床病理学特征包括：性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、是否行辅助放化疗、血清中癌胚抗原（CEA）和糖类抗原（CA199）水平。肿瘤的TNM分期根据美国癌症联合委员会（AJCC）制定的胃癌TNM分期（第7版）标准确定。本研究得到第二军医大学长海医院的科研机构审查委员会的批准，所有患者均被告知并签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 检测方法和指标 患者术前一周内采集静脉血进行血细胞计数及分类，计算中性粒细胞与淋巴细胞的比值。以NLR=4为分界点［6-7］，将其分为高NLR组和低NLR组。采用免疫组织化学法检测胃癌组织中CD66b抗原，判断胃癌组织中CD66b蛋白的表达从而鉴定组织中的肿瘤相关中性粒细胞［8］。石蜡包埋的组织切片，由上海芯超生物科技有限公司制成组织芯片。65℃烤片，常规脱蜡水化，用30%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。用柠檬酸盐缓冲液高压热修复。抗CD66b抗体（G10F5，BD Biosciences，美国，抗体稀释倍数1:400）4℃孵育过夜。免疫组织化学试剂盒（KIF-5920，maxim，美国）用于孵育二抗及DAB显色。随后苏木素复染，脱水透明封片。1.2.2 免疫组织化学染色结果判断标准 用Aperio公司（美国）病理切片扫描成像系统扫描组织芯片并用Aperio Image Scope version软件（美国）读片。CD66b蛋白存在于肿瘤细胞间质，出现黄褐色或棕色颗粒为阳性。选择5个染色均匀的区域，在0.05 mm2的面积内计算CD66b中性粒细胞浸润数目，取其平均值视为该组织内中性粒细胞的浸润个数。免疫组织化学评分由4位研究者（2名病理专家和2名临床医师）采用盲法阅片判定，评分有较大分歧时经协商解决。取4例计数的平均值作为该样本最终结果。将结果的中位数作为标准，将126例胃癌患者分为高浸润组和低浸润组。

1.2.3 随访 患者首程治疗结束后2年内每3个月复查1次，3～5年内每6个月复查1次。复查主要包括常规体格检查、血常规、肝肾功能及影像学检查。通过电话进行随访。随访开始于患者出院，终止于患者死亡，随访截止时间为2015年6月。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。外周血中NLR联合胃癌组织中CD66b蛋白表达与临床病理因素的相关性，采用χ2检验或Mann-Whitney U进行检验。采用Kaplan-Meier生存分析及Log-rank比较外周血中NLR联合胃癌组织中CD66b中性粒细胞浸润高低与预后的关系。多因素Cox回归分析用于识别与胃癌预后相关的独立危险因素。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD66b在胃癌组织中的表达

在126例胃癌组织样本中，63例CD66b高表达，63例CD66b低表达，且均表达于胃癌组织间质内。胃癌组织CD66b高、低表达的代表性免疫组织化学检测结果见图1。

图1 CD66b在胃癌组织中的表达（IHC×200）

2.2 外周血中NLR联合胃癌组织中TANs浸润与临床病理特征之间的关系

将外周血中NLR高低与胃癌组织中TANs浸润高低联合后，共分为4个组，分别为NLR高合并TANs高浸润组、NLR高合并TANs低浸润组、NLR低合并TANs高浸润组和NLR低合并TANs低浸润组。经分析，发现外周血高NLR联合胃癌组织TANs低浸润患者与年龄、性别、TNM分期、辅助放化疗、血清CEA水平不相关。外周血高NLR联合胃癌组织TANs低浸润患者与分化程度和肿瘤大小相关，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 胃癌患者外周血NLR联合组织中CD66b蛋白表达与临床病理特征的相关性

2.3 生存分析

生存分析及Log-rank分析结果显示，外周血高NLR联合胃癌组织TANs低浸润组生存率最低，外周血低NLR联合胃癌组织TANs高浸润组生存率最高，而外周血高NLR联合胃癌组织TANs高浸润组与外周血低NLR联合胃癌组织TANs低浸润组比较，差异无统计学意义，其他各组差异均具有统计学意义（P＜0.05，图2）。

2.4 单因素及多因素Cox回归分析

患者总生存期的单因素Cox回归分析显示，外周血高NLR联合胃癌组织TANs低浸润（P=0.008），肿瘤个体较大（P＜0.001）、高TNM分期（P＜0.001）、辅助放化疗（P=0.005）、血清CA199水平高（P=0.012）是影响胃癌预后的独立危险因素；将单因素回归分析有意义的变量进一步纳入Cox多因素回归分析显示，外周血高NLR联合胃癌组织TANs低浸润（P=0.042），肿瘤个体大（P=0.048）、高TNM分期（P=0.005）、辅助放化疗（P=0.026）、血清CA199水平（P=0.015）是影响胃癌预后的独立危险因素（表2）。患者无病生存期的单因素Cox回归分析显示，外周血高NLR联合胃癌组织TANs低浸润（P=0.008），肿瘤较大（P＜0.001）、高TNM分期（P＜0.001）、辅助放化疗（P=0.005）、血清CA199水平较高（P=0.014）是影响胃癌预后的独立危险因素；进一步纳入多因素回归分析显示，外周血高NLR联合胃癌组织TANs低浸润（P=0.046），高TNM分期（P=0.005）、放化疗（P=0.028）、血清CEA199水平较高（P=0.024）是影响胃癌预后的独立危险因素（表3）。

图2 胃癌患者血液NLR联合组织中CD66b表达的生存分析

表2 胃癌患者总生存期的单因素及多因素Cox回归分析

表3 胃癌患者无病生存期的单因素及多因素Cox回归分析

表3 胃癌患者无病生存期的单因素及多因素Cox回归分析（续表3）

3 讨论

外周血及组织中的中性粒细胞具有相同的来源。中性粒细胞来源于骨髓造血干细胞，在骨髓干细胞分化发育后，进入血液或组织中。当局部组织发生感染时，中性粒细胞能够渗出血管，通过趋化运动等机制到达感染部位，发挥机体免疫防御功能。然而，随着研究的进展，除了发挥抗感染作用，组织中的TANs与胃癌的发生、发展也存在密切关系［9］。有研究发现，TANs受到来源于肿瘤微环境的不同信号影响可分化为N1、N2型，N1型主要通过杀伤病原体，产生免疫反应等抑制肿瘤的进展，N2型主要通过促进细胞的增殖、侵袭，细胞外基质的重建，血管、淋巴管的形成等而促进肿瘤的进展［10］。由此可见，血液和组织中的中性粒细胞之间可能存在着某种联系，共同促进胃癌的进展。目前，尚缺乏区分N1、N2型中性粒细胞较好的标志物，而CD66b作为中性粒细胞的标志物被广泛应用。因此，本研究检测血液中NLR和胃癌组织中总的中性粒细胞的浸润情况，研究其联合作用对胃癌患者预后的预测价值。

目前，虽缺乏外周血中NLR联合胃癌组织中的中性粒细胞浸润与胃癌预后的研究，但关于外周血NLR与胃癌预后关系的研究较多。Jin等［11］对1 220例非手术治疗的晚期胃癌患者的研究中发现，NLR升高是患者总生存期缩短的独立预后因素。Aliustaoglu等［12］发现术前NLR是行根治性切除并在术后实施辅助化疗的胃癌患者总生存期和无病生存期的独立危险因素。Hottenrott等［13］指出NLR升高是相对早期胃癌病例的独立危险因素。本研究结果显示，外周血NLR高联合组织中性粒细胞低浸润提示胃癌患者预后较差，与上述研究结果一致。关于胃癌组织中TANs与胃癌预后相关性的研究结果说法不一。有研究显示，胃癌组织中TANs高浸润提示预后较好［5］。Zhao等［14］研究表明，胃癌组织中TANs高浸润提示预后较差。出现此差异的可能原因为前者采用CD66b标记中性粒细胞，后者采用CD15标记中性粒细胞。CD15不仅可以表达于中性粒细胞，也可表达于单核细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和肿瘤细胞等，可能造成了对预后估计的偏差［15］。CD66b是高度糖基化的CEA家族蛋白，由CGM6基因编码，表达于嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。使用高通量筛选流式细胞术检测发现CD66b识别中性粒细胞的纯度为99%［16］，且CD66b已被广泛应用于肾细胞癌，肝癌和胃癌等肿瘤以识别嗜中性粒细胞［17-18］。本研究结果表明，中性粒细胞高浸润胃癌患者预后较好，与既往研究结果一致，具有一定的可靠性。

血液和组织中的中性粒细胞均可影响胃癌患者的预后。外周血NLR升高引起胃癌患者预后较差的原因可能为：1）中性粒细胞升高可引起生长因子和血管内皮生长因子等一系列促肿瘤血管形成的物质增加，从而促进肿瘤的生长和增殖［19-20］；2）NLR的升高提示淋巴细胞计数相对或绝对减少，从而降低机体对肿瘤的免疫应答［21］。而组织中N2型TANs可以通过产生活性氧、生成基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子等促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、细胞外基质重建，血管、淋巴管的形成等。另外，N1型TANs可通过分泌基质金属蛋白酶，与肿瘤细胞直接作用等发挥抗肿瘤作用，也可招募CD8+T淋巴细胞抑制肿瘤的进展。目前，关于血液和肿瘤组织中中性粒细胞相互作用的研究较少。本研究结果表明，外周血NLR高联合组织TANs低浸润提示胃癌患者预后较差，推测血液中的中性粒细胞渗透血管到达组织后，可能仍然与血液中的中性粒细胞存在相互作用。因此，未来亟需深入探究血液及胃癌组织中的中性粒细胞相互作用方式与促瘤或抑瘤作用及其机制，不仅可引导免疫系统发挥抗肿瘤作用，也可为寻找胃癌治疗新靶点提供科学依据。

寻找一种精确的评价肿瘤患者预后的方法是一直以来研究的热点。TNM分期是目前评估胃癌患者预后的主要方法。但判断预后不能仅靠单一指标，既要考虑到肿瘤相关的因素（如TNM分期）还应考虑到患者本身的免疫状态，以及肿瘤与机体的免疫炎症、反应介质等。通过多因素Cox回归分析发现：外周血高NLR联合胃癌组织中TANs低浸润、肿瘤体积大、高TNM分期、辅助放化疗、血清CA199水平是影响胃癌患者预后的独立危险因素。因此，以上述指标建立一个综合的预后评分系统更能准确地评估患者的预后，但需要更有力的证据支持。

综上所述，术前外周血NLR联合胃癌组织中TANs浸润可作为判断胃癌患者术后预后的指标，且术前外周血NLR高联合胃癌组织中TANs低浸润胃癌患者的预后较差。外周血NLR高联合胃癌组织TANs低浸润有望成为预测胃癌预后的新的生物标志物，且两者联合可提高对预后的预测能力。本研究不足之处在于样本量偏小及回顾性研究，对于胃癌患者外周血液NLR联合胃癌组织中TANs浸润与患者临床病理特征及预后的相关性仍需进一步研究。

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