mad2检测作为小细胞肺癌早期诊断潜在指标的临床研究*

吴洋 谭立明 陈娟娟 李华 应后群 蒋永清 吴琼 于国芳 田永建 余建林 曾婷婷颜玲仙 刘川

肺癌（lung cancer，LC）是导致全世界癌症相关死亡的首要原因［1］。小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）在所有LC中占14%左右［2］。目前SCLC的发病机制尚不明确。SCLC分化极差、侵袭性强、生长迅速，常发展到晚期才出现明显临床表现，故早诊断、早治疗是关键。目前SCLC诊断主要依靠病理学检查，属于有创性检查。因此亟需无创性指标用于早期SCLC的诊断。NSE（neuron specific enolase）是目前临床诊断SCLC最常用的指标，但是由于NSE敏感度不高，所以需其他指标用来联合诊断SCLC。研究表明大部分肿瘤细胞都呈非整倍体，称之为染色体不稳定（chromosome instability，CIN）［2］。在细胞有丝分裂过程中，有丝分裂纺锤体检测点（spindle assemble checkpoint，SAC）的功能异常导致染色体在高等真核生物细胞中错误分离，进而直接导致CIN的发生。SAC主要由Mad2，Bub1和Bub2组成［4-6］。mad2基因是调控Mad2蛋白表达的基因，在SAC监测有丝分裂过程中染色体着丝粒与微管结合过程中起着重要的调控作用。但关于mad2在小细胞肺癌中的表达尚无相关研究报道。本研究利用qt-PCR检测SCLC中mad2的表达，联合抗纺锤体抗体（anti-nuclear mitotic spindle apparatus antibody，MSA）及抗着丝点抗体（anticentromere antibody，ACA），探讨其在SCLC诊断中的临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 患者一般特征

纳入的患者均来自南昌大学第二附属医院自2011年12月至2016年12月门诊及住院的患者，患者一般特征见表1。其中120例SCLC患者（男性89例，女性31例，年龄26～86岁，平均62岁，吸烟病史63例，淋巴结转移70例），110例非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者（男性65例，女性45例，年龄35～84岁，平均64岁，吸烟病史53例，淋巴结转移51例），115例肺结节（pulmonary nodule，PN）患者（男性61例，女性54例，年龄32～87岁，平均59岁，吸烟病史55例）。

1.2 方法

1.2.1 研究设计 本研究为前瞻性、随机对照临床试验，旨在评价mad2检测在早期诊断SCLC的临床价值。本研究通过南昌大学第二附属医院伦理委员会批准许可。

1.2.2 入组和排除标准 SCLC诊断标准参考美国NCCN小细胞肺癌临床实践指南［7］；NSCLC诊断标准参考美国NCCN非小细胞肺癌临床实践指南［8］；PN诊断标准参考美国胸科医师学会（ACCP）制定的PN评估指南［9］。

入组标准：1）知情、自愿参与；2）诊断明确，临床、影像学、病理组织学资料完整；3）对入选患者的资料重新评估，否定合并其他自身免疫性疾病及合并其他癌症；4）健康对照组者血常规、血压、血糖、血脂、胸片、心电图及肝胆胰检查无异常。

排除标准：1）肿瘤分型不明确或非原发性肿瘤；2）合并严重心、肺、肝脏等系统疾病，甲状腺疾病、糖尿病；3）妊娠或哺乳期妇女；4）不符合纳入标准者。

1.2.3 标本的采集 1）mad2 mRNA的检测标本采用EDTA抗凝管采集空腹状态下的静脉血2.0 mL，利用RNA Trizol试剂盒提取RNA，-80℃冻存，避免反复冻融。2）NSE，MSA及ACA的检测标本采用空腹采静脉不抗凝血3.0 mL左右，1 028×g离心15 min分离血清，-80℃冻存，避免反复冻融。

1.2.4 荧光定量PCR（qt-PCR） 1）利用RNA Trizol试剂盒（采购自大连宝生物有限公司）提取总RNA。mad2 mRNA的长度为163 bp，GAPDH作为内参。DNA Ladder长度为1 kb。利用荧光定量试剂盒按以下步骤扩增mad2 mRNA特异性序列。2）引物序列：mad2 mRNA上游引物序列：5'-AGCTCCTTTTGACCTTCATTTC-3'；下游引物序列：5'-TCCATTGCTTCATAGGTTCAAG-3'；GAPDH上游引物序列：5'-ACGGTGACATTTCTGCCACT-3'；下游引物序列5'-TGGTCCCGACTCTTCCCATT-3'。反应体系：2×Master Mix（Roche）5.0 μL，上游引物序列0.3 μL，下游引物序列0.3 μL，加dd H2O至总体积为9 μL。扩增步骤：95℃预热5 min，95℃变性持续30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，重复35个循环，最后在72℃下最终延伸7 min。收集产物行荧光定量检测。

1.2.5 NSE检测 NSE运用电化学发光方法检测，试剂盒（购自上海罗氏诊断产品有限公司）的cutoff值为17.0 ng/mL。

1.2.6 间接免疫荧光法检测MSA和ACA抗体 试剂由德国欧蒙实验诊断有限公司生产，MSA抗体采用提供的全新Hep-20-10细胞株，ACA采用Hep-2细胞，4℃保存备用。标本按试剂要求稀释（1:100稀释），取25 μL于玻片上，覆上生物膜片，室温孵育30 min，洗去游离标本，用洗液浸泡5 min，沥干加20 μL异硫氰酸荧光素标记二抗，避光室温孵育30 min，洗去游离二抗，用洗液浸泡5 min，沥干后封片。荧光显微镜观察结果。

1.3 统计学分析

统计学分析采用SPSS 23.0软件。利用EpiCalc 2000计算实验样本量。计数资料以例数（百分比）描述。mad2检测数据呈非正态分布，采用Wilcoxon秩和检验；MSA和ACA数据采用χ2检验；一致性分析计算Kappa值；对计量资料作受试者特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC），计算ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）。

2 结果

2.1 患者临床特征

120例SCLC、110例NSCLC、115例PN患者纳入研究。3组患者在年龄、性别、吸烟史上均无差异，SCLC与PN组淋巴结转移无差异。NSE在SCLC与NSCLC组中表达明显高于PN组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；NSE在SCLC组与NSCLC组中差异均无统计学意义，结果见表1。

表1 患者临床特征

2.2 mad2表达情况

mad2在SCLC组及NSCLC组中均有表达，PN组中无表达，结果见图1；在qt-PCR定量表达分析中，与NSCLC组相比，mad2在SCLC组中表达量更高（P＜0.05），结果见图2。

图1 mad2表达琼脂糖凝胶电泳图

2.3 mad2诊断SCLC的ROC曲线

mad2诊断SCLC的ROC曲线下AUC是0.799，95%置信区间（1.297、1.314），诊断敏感性53.32%，特异性88.73%，结果见图3。

图2 mad2荧光定量表达图

图3 mad2诊断SCLC的ROC曲线

2.4 mad2联合NSE诊断SCLC

NSE诊断SCLC的敏感性为33.02%，特异性为93.01%，约登指数为0.26；mad2联合NSE诊断SCLC的敏感性为63.23%，特异性为85.31%，约登指数为0.49，结果见表2。

表2 mad2联合NSE诊断SCLC

2.5 MSA和ACA的表达情况

2.5.1 MSA、ACA与SCLC相关性分析 MSA与ACA的IIF图形（图4，5），MSA和ACA与SCLC有较强的相关性，OR值分别为6.94和5.60，见表3。

2.5.2 MSA及ACA诊断SCLC的临床价值评价 诊断SCLC的敏感性及特异性最高的为MSA，敏感性35.00%，特异性96.00%，阳性预测值0.79，阴性预测值0.73，阳性似然比8.75，约登指数0.31，见表4。

2.6 mad2联合MSA和ACA串并联分析

2.6.1 mad2联合MSA及ACA一致性分析 mad2联合MSA诊断SCLC的Kappa值0.486（P＜0.01），mad2联合ACA诊断SCLC的Kappa值0.421（P＜0.01），mad2与MSA及ACA一致性中等，所以mad2可以联合MSA与ACA诊断SCLC，见表5。

2.6.2 mad2检测联合MSA和ACA诊断串并联分析mad2检测联合MSA和ACA并联分析诊断SCLC的敏感性83.31%，特异性79.34%，约登指数0.62，串联分析诊断SCLC的敏感性65.32%，特异性93.35%，约登指数0.59，见表6。

图4MSA核型

图5ACA核型

表3 MSA及ACA与SCLC相关性分析

表4 MSA及ACA诊断SCLC的临床价值评价

表5 mad2联合MSA及ACA一致性分析

表6 mad2联合MSA及ACA诊断串并联分析

3 讨论

肿瘤的发生与CIN密切相关。有丝分裂过程中姐妹染色体的异常分裂常常导致非整倍体的形成，导致CIN的发生［10-12］。在细胞有丝分裂过程中，SAC在调控染色体分裂中发挥至关重要的作用。在有丝分裂后期，SAC调控染色体与着丝点及微管附着，一旦形成异常的染色体，SAC会立即阻止染色体与着丝点及微管附着［13］。调节Mad2蛋白表达的mad2异常导致SAC功能受到抑制，进而激活APC/C。APC/C通过解除SAC对染色体的监控使得异常的染色体进入有丝分裂后期导致非整倍体细胞的形成，导致肿瘤发生［14］。因此，在肿瘤发生的早期即可检测到mad2异常表达。mad2是高度保守的基因，极少发生突变。但是mad2在各种肿瘤中表达量各异，在NSCLC中该基因过度表达［15］，而在胃癌和卵巢癌中表达降低［5，16］，机制暂不明确。目前暂无mad2在SCLC中表达的相关研究报道，可能与SCLC研究热度不高有关。本研究首次通过qt-PCR检测mad2在SCLC中的表达情况。

PN是肺癌发生的前哨。本研究通过qt-PCR发现mad2在NSCLC组中表达上调，与PN组比较差异有统计学意义（P＜0.05），这与齐鲁的研究报道相符［17］；mad2在SCLC组中过度表达，与肺结节组相比差异也有统计学意义（P＜0.05），提示mad2在SCLC发生发展中起到重要作用，这与mad2过度表达导致SAC功能受到抑制有关，具体机制尚待进一步研究；有趣的是mad2在NSCLC组与SCLC组表达量有差异（P＜0.05），mad2表达量在SCLC组显著高于NSCLC。根据mad2表达量的差异可用于早期鉴别诊断SCLC，NSCLC和PN。当mad2表达量95%置信区间（1.297、1.314）时诊断SCLC的ROC曲线下AUC面积为0.799，特异性88.73%，诊断价值中等，故mad2有作为SCLC诊断指标的潜能。但mad2诊断SCLC的敏感性53.32%，敏感性不高，故应联合其他生物学指标。NSE是目前临床上SCLC常用标志物，本研究发现NSE诊断SCLC的敏感性为33.02%，特异性为93.01%，联合mad2后敏感性为63.23%，敏感性显著提高，mad2联合NSE诊断SCLC在临床上是个理想的选择。刘冬青发现LC与ACA关系密切，但是缺乏ACA在LC诊断中的研究［18］。Giladi等［19］通过基础研究发现纺锤体的异常导致CIN发生，与肿瘤的发生密切相关。本研究在前期工作中发现SCLC与MSA和ACA的有丝分裂相关的抗体密切相关［20］，与报道相符。本研究发现SCLC与MSA及ACA相关性较好，OR值分别为6.94、5.60；且MSA及ACA在诊断SCLC上具有很强的临床价值，特异性分别为96.00%和92.89%，阳性预测值分别为0.79和0.69，阴性预测值分别为0.73和0.71，阳性似然比分别为8.75和4.21，阴性似然比分别为0.68和0.75，约登指数分别为0.32和0.22，故MSA及ACA可以作为诊断SCLC的理想指标。但MSA及ACA诊断SCLC的敏感性低，分别为35.00%和30.00%，因此联合mad2检测、MSA和ACA检测行串并联分析非常必要。mad2检测在诊断SCLC方面与MSA及ACA相关性较好，Kappa值分别为0.49和0.42。通过计算发现，mad2检测串联MSA和ACA检测能够明显提高mad2检测诊断SCLC的敏感性，其敏感性达到83.31%，显著高于任何单一指标的敏感性；并联分析能显著提高其特异性，特异性达到93.35%。因此通过联合mad2检测、MSA和ACA检测来诊断SCLC是一种理想方案。

综上所述，联合检测mad2，MSA和ACA可用于SCLC与NSCLC及PN的早期鉴别诊断，为临床诊断SCLC提供一种新方案。

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