知柏地黄汤对大鼠血清及尿液差异代谢物的影响

叶丽 陈仙英 陈宇 徐莉⋆

知柏地黄丸为众多六味地黄丸加减方之一，由六味地黄丸（熟地黄，山茱萸，山药，泽泻，牡丹皮，茯苓）加知母，黄柏而组成，加强其滋阴清相火的作用。本方的主要功效是滋阴降火，主治肝肾阴虚，虚火上炎证。多用于阴虚火旺，潮热盗汗，口干咽痛，耳鸣，小便短赤等症。现代临床研究发现，知柏地黄丸有调节免疫系统、内分泌、血糖血脂等［1-2］诸多药理作用。作者应用UPLC-MS测定知柏地黄汤组与空白对照组大鼠血清、尿液代谢物，以及这些差异代谢物所在通路，进一步阐明知柏地黄汤对大鼠机体的一些作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验仪器：Centrifuge 5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；超低温冰箱（日本SANYO公司）；1260 HPLC-6520 Q-TOF/MS、Eclipse Plus C18色谱柱、Mass Hunter软件、Mass Profiler Professional（MPP）均来自（美国安捷伦科技有限公司）。（2）实验药物与试剂：知母24g，黄柏24g，熟地黄24g，山茱萸12g，山药12g，泽泻9g，茯苓9，丹皮9g，以述中药材均由浙江中医药大学中药饮片厂提供。中药水煎剂：上述中药材以单蒸水800ml煎煮1h，共煎煮2次，然后将2次的中药水煎剂混合，再以R202型旋转蒸发器将其浓缩成1g/ml。质谱参比液（美国安捷伦科技有限公司）；质谱校准液（美国安捷伦科技有限公司）；c色谱级（阿拉丁公司）；甲醇、乙腈均为色普级（美国Tedia公司）。（3）实验动物：Sprague Dawley（SD）大鼠，清洁级，雌性，6～8周龄，体重（150±20）g，共26只，由浙江中医药大学动物实验中心提供，全封闭清洁级状态下隔离饲养，室温20℃，相对湿度40%～60%，每日光照12h，自由摄食、饮水。

1.2 方法 （1）给药和样本收集：将26只SD大鼠随机分为2组：正常对照组（14只）和知柏地黄汤组（12只）。两组大鼠均以普通饮食喂养，其中正常对照组予生理盐水灌胃0.1ml/（10g·d），知柏地黄汤组大鼠予知柏地黄汤水煎剂（1g/ml）进行灌胃0.1ml/（10g·d）。（2）尿液样本收集：于实验第21天分别收集大鼠尿液，共收集2次；尿液样品加入叠氮化钠后保存于-80℃冰箱，以用于尿液代谢组学研究。（3）血清样本收集：大鼠给药21d后，采用腹腔静脉取血，全血静置30min后，采用3000r/min×10min，4℃离心，取血清-80℃保存，以用于后续血清代谢组学检测。（4）样本处理：①尿液样本前处理：室温条件下解冻“样本收集”所得尿样，取150μl尿样置于有450μl超纯水的离心管中，涡旋1min充分混匀，然后采用12000r/min×10min，4℃低温高速离心后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，弃去初始滤液，样品即可进行LC/MS分析。②血液样本前处理：在室温下解冻采集血清样品，取150μl置于离心管中，加入450μl乙腈沉淀蛋白，涡旋30s，在静置10min后，采用12000r/min×10min，4℃低温高速离心，取300μl上清液用去离子水1：1稀释，稀释后的600μl血清样品用0.22μm尼龙膜过滤，弃去初始滤液，用于液相质谱分析。（5）色谱与质谱条件优化：经过对色谱条件的考察，最终确定的色谱条件：Eclipse Plus C18色谱柱（2.1×50mm，1.8μm）；自动进样器温度控制在5℃；柱温为35℃；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流速：0.2ml/min，后运行时间为4min；进样量为5μl；为样品的改善分离的效果和检测灵敏度，实验采用梯度洗脱，洗脱梯度：0min，95%A 5%B；4min，90%A 10%B；17min，55%A 45%B；22min，5%A 95%B。优化后质谱的主要参数为：采用电喷雾离子源（ESI+）；采集范围：m/z 50～1000；干燥气：N2，流速为10L/min，干燥气温度为350℃；毛细管电压、碎裂电压、锥孔电压分别为4000V、180V、60V；雾化气压力为310KPa。质谱数据采用Centroid模式保存，采集速率为2spectrum/s。在分析过程中，使用质谱参比液，对仪器的运行进行监测，校准仪器的实时质量偏差。

1.3 统计学方法 采用Mass Profiler软件（Agilent公司），分析模型组和对照组的原始数据进行预处理。并在EXCEL2010软件中进行归一化及后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量（rt_mz，即保留时间_质荷比）、分子量（mass）观察量（样本）和峰强。本项目样本在该模式下共得到1069个features。将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件（版本13.0）进行无监督的主成分分析（PCA）和有监督的偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）对数据进行模式识别。并进一步采用有监督式方法OPLS-DA进行建模分析。采用 OPLS-DA模型的VIP（Variable Importance in the Projection）值（阈值 ＞1），并结合 t-test的 P 值（P＜0.05）来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库（Metlin）（比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass）。将得到的总差异物质输入到MetaboAnalyst 3.0中，获得这些差异物质所在的代谢通路。

2 结果

知柏地黄汤组和对照组小鼠血清和尿液的典型UPLC/MS总离子色谱图见图1。先行血清和尿液样本的主成分分析（PCA），以显示评分图间的组间分离趋势，然后OPLS-DA模型知柏地黄汤组与对照组间的分离更清晰。根据变化的代谢物，通过搜索KEGG PATHWAY数据库鉴定相关途径。在血清样品中，三种代谢途径发生明显变化，包括脂肪酸生物合成，甘油磷脂代谢和亚油酸代谢途径。其中知柏地黄汤组相对于空白组棕榈酸、亚油酸、油酸含量下降，而溶血磷 脂 胆 碱 LysoPC［16：1（9Z）］、LysoPC（14：0）、LysoPC（20：0）、LysoPC（16：0）、LysoPC［18：2（9Z，12Z）］、LysoPC［20：4（5Z，8Z，11Z，14Z）］上升。在尿液样品中，发现缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径，甘油磷脂代谢和苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成均有显著变化。知柏地黄汤组中的苯丙酮酸、亮氨酸、缬氨酸、磷酸胆碱含量相对空白组上升。

图1 血清、尿液样本离子流色谱图

3 讨论

缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸生物合成有11种代谢物，本研究在该途径中涉及2种代谢物。其中亮氨酸和缬氨酸均为支链氨基酸（BACC），不仅是必需氨基酸，也是重要的营养分子。涉及胰岛素信号、骨骼肌能量调节和肌肉蛋白合成等重要生物过程。BACC主要在肌肉组织中代谢，使其在肌肉细胞氧化同时产生能量ATP。其可以更快的转氨酶和完全氧化，三磷酸腺苷（ATP）的氧化比其他氨基酸高。研究表明，亮氨酸可以激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，增加蛋白质合成和抑制蛋白质分解代谢［3-5］，这在调节蛋白质代谢中发挥作用。 BACC在骨骼肌的内源性合成中为谷氨酰胺提供α-氨基［6］，而谷氨酰胺被认为是免疫系统细胞的主要能量底物［7］，因此BACC也可以被认为是免疫系统的一部分。据报道，缬氨酸和亮氨酸缺乏可以抑制小鼠的正常免疫功能［8］。羊可以加入亮氨酸和α-KLC，调节其T淋巴细胞亚群的免疫功能［9］。因此，亮氨酸在体内可以用于蛋白质的合成，在特殊的生理期可以作为能量来源，调节免疫功能。临床中的一些上火症状所表现出的炎症反应，这些致炎因子对机体的攻击而产生一些免疫功能紊乱。而知柏地黄汤的主要功效是滋阴降火，服用后使机体亮氨酸、缬氨酸含量增多，从而调节机体免疫功能，缓解炎症反应，从而起到降火的作用。

另有较多研究表明，BCAA在脂质代谢中起重要作用。在缺乏亮氨酸的情况下，白脂肪组织中激素敏感性脂肪酶（HSL）介导的脂质动员增强，褐色脂肪组织中解偶联蛋白1（UCP1）的表达水平升高，脂肪含量迅速降低［10］。BCAA的强化摄入可以降低人体肥胖的风险，动物实验也表明饲料补充剂BCAA可以降低饲料摄入量和体重［11-12］。BCAA分解代谢的重要酶BCAT激活和运动的肌糖原分解同步，表明补充BCAA有可能加强运动后的脂质氧化，并在提供能量的作用过程中［13］。这表明BCAA不仅作为能源，且在运动中也加强了脂质的氧化分解。而甘油磷脂途径相关代谢物相对含量增加。可能表明身体脂肪储存减少，并通过消耗甘油磷脂途径相关物质，刺激身体的能量消耗。

知柏地黄汤组大鼠体重与对照组比较有所降低，可能与缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸生物合成途径和甘油磷脂途径代谢物含量增加有关。而知柏地黄汤组尿液中缬氨酸和亮氨酸的增加可进一步证实知柏地黄汤能够提供氧化能量，提高机体抗氧化能力，促进蛋白质合成，提高免疫功能。这为临床使用知柏地黄汤提供更多的药理依据。

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