大鼠Pig-a基因突变试验中N-乙基-N-亚硝基脲和环磷酰胺量-效关系的优化

刘香梅，李培宁，刘冬虹，黄宇锋，庞增雄，陈梓灵，徐颖愉，丘智峰

(广州质量监督检测研究院，广州 511447)

Pig-a基因位于X染色体上，作为管家基因，其同源基因编码区的结构和功能在人、大鼠、小鼠都有高度的保守性，该基因位点的突变可间接导致细胞表面锚蛋白(GPI-AP)的缺失，如CD59、CD55等，提示我们Pig-a基因突变试验可用于检测体内基因突变终点遗传毒性试验。

目前，常用的遗传毒性试验阳性物，如乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea，ENU)、4-硝基喹啉-N-氧化物(4NQO)，环磷酰胺(cyclophosphamide, CP)，苯并芘等也可作为Pig-a基因突变试验阳性物开展试验[1-3]，但是致突变的效果不同。研究发现，多能干细胞及成熟的血细胞均可发生Pig-a基因突变而导致的GPI-AP缺失，因此外周血是最早用于研究Pig-a基因突变，而外周血中不同细胞的受累程度不同，红细胞较少发生GPI-AP的自发缺失，因此可以将外周血红细胞表面CD59缺失率作为Pig-a基因体内突变试验检测终点[4]。传统遗传毒性试验具有周期长、成本较高、且大多不能有效反映基因突变终点，从而造成其体外和体内试验结果的一致性也欠佳等缺陷，而利用Pig-a基因突变试验原理建立的致突变检测方法则可以解决这些问题。

本试验研究不同剂量的ENU和CP对SD大鼠外周血红细胞表面锚蛋白CD59缺失的影响，从而筛选适合于遗传毒性试验的优选阳性物及剂量，确定实验周期，以优化Pig-a基因突变试验检测方法，用于化妆品致突变性安全评价。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性24只，180～200 g，40～50日龄，购自南方医科大学实验动物中心[SCXK(粤)2016-0041]，伦理审查编号：2017-01-07。大鼠饲养于本单位屏障实验室[SYXK(粤)2014-0137]，自由进食进水，实验室温度20℃～26℃，湿度40%～70 %。

1.2 主要试剂及仪器

ENU，CAS：759-73-9，LOT# MKBX 4322 V，Sigma；CP，批号：SJ0121RA14，上海源叶生物科技有限公司；DPBS，LOT：1546333，2017-02，Gibco；胎牛血清(FBS)，批号：141012，杭州四季青生物工程材料有限公司。FITC Mouse Anti-Rat CD59，货号：550976，批号：4233743；PE Mouse Anti-Rat CD45抗体，货号：554878，批号：7054649，BD公司；

BD FACSCanto II 流式细胞仪；KDC 1044低速离心机。

1.3 实验方法

动物经检疫合格后，将SD大鼠按体重和外周血RBCCD59-随机分为4组，即溶媒对照组，ENU 10 mg/kg给药组，ENU 40 mg/kg给药组和CP 40 mg/kg给药组，每组6只。采用腹腔注射染毒，各组染毒1次，溶媒对照组注射PBS溶液。在染毒前和染毒后7、14、28、42、56 d进行眼眶静脉丛采血，采用乙醚麻醉，称重并采抗凝血，置于冰上保存备用。

吸取1.5 μL抗凝血，加入200 μL含1%胎牛血清的PBS溶液的流式管中，轻微震荡数秒。加入2.5 μL anti-CD45和1 μL anti-CD59，轻轻转动，使抗体混合均匀，室温暗处避光孵化约30 min。离心弃上清液，加入约0.5 mL含1%胎牛血清的PBS溶液，轻轻转动，上流式细胞仪检测，每个样本检测100万个红细胞[5-7]，分析大鼠外周血RBCCD59-发生率。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 ENU和CP对大鼠体重的影响

与溶媒对照组比较，ENU 10 mg/kg给药组和ENU 40 mg/kg给药组各时间点体重及体重增量均无明显影响(P> 0.05)，CP 40 mg/kg给药组给药后时间点体重及体重增量均下降(P< 0.05)。说明ENU 10 mg/kg和40 mg/kg剂量对大鼠体重没有影响，而40 mg/kg剂量的CP可降低大鼠体重。结果见表1、图1。

表1 ENU和CP对各时间点大鼠体重的影响结果

注：与溶媒对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05，**P< 0.01.

图1 ENU和CP对各时间点大鼠体重的影响结果Fig.1 Effect of ENU and CP on the body weight of rats at different time points

2.2 ENU和CP对大鼠外周血RBCCD59-发生率的影响

与溶媒对照组比较，CP 40 mg/kg给药组给药后第28、42和56天，ENU 10 mg/kg给药组给药后第42、56天，ENU 40 mg/kg给药组给药后第7、14、21、28、42和56天外周血RBCCD59-发生率均升高(P< 0.05)。与ENU 10 mg/kg给药组比较，ENU 40 mg/kg给药组给药后第7、21、28、42和56天外周血RBCCD59-发生率均升高(P< 0.05)。结果见表2、图2。

3 讨论

随着科学研究的发展，如何最大限度减少实验动物的使用数量，快速又准确的得出遗传基因的改变是现阶段研究的重点。在Pig-a基因突变检测方法建立的过程中，国内外研究发现，Pig-a基因突变造成外周血红细胞表面CD59的缺失是一个逐渐累积的过程，这对检测有微弱遗传毒性的物质是一种很有意义的方法。目前的研究主要集中在阳性诱变剂ENU、4NOQ、EMS等的筛选、检测指标的种类及相关性等方面。而CP作为传统遗传毒性试验检测方法中最常见的阳性致突变剂，在Pig-a基因突变试验中研究却甚少。本试验主要研究CP传统遗传毒性试验常用剂量 40 mg/kg和同剂量下的ENU，以ENU 10 mg/kg剂量，于给药后第7～56天对外周血RBCCD59-发生率的影响。

表2 ENU和CP对各时间点大鼠外周血RBCCD59-发生率的影响结果

注：与溶媒对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与ENU10 mg/kg给药组比较，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05，**P< 0.01. Compared with the ENU 10 mg/kg group，#P< 0.05，##P< 0.01.

注：A：空白对照FSC-A/SSC-A图；B：空白对照PE-A/SSC-A图；C：空白对照FITC-A/SSC-A图；D：溶媒对照组；E：CP 40 mg/kg给药组；F：ENU 10 mg/kg给药组；G：ENU 40 mg/kg给药组。图2 ENU和CP对大鼠外周血RBCCD59-发生率的影响结果Note.A: FSC-A/SSC-A chart of the blank group. B: PE-A/SSC-A chart of the blank group. C：FITC-A/SSC-A chart of the blank group. D: Control group. E: CP 40 mg/kg group. F: ENU 10 mg/kg group. G: ENU 40 mg/kg group.Fig.2 Effect of ENU and CP on the loss rate of RBCCD59- at different time points

试验结果显示，CP 40 mg/kg给药组给药后第28天出现阳性结果，至给药后第56天仍有显著性差异，检出阳性结果的时间较ENU时间延后，且引起大鼠体重的下降较为明显，不推荐作为该实验的阳性致突变物。ENU 40 mg/kg给药组和10 mg/kg给药组分别于给药后第7、42天出现稳定的阳性结果，且ENU40 mg/kg剂量较10 mg/kg剂量引起外周血RBCCD59-发生率高，但对大鼠体重没有影响。可以得出，相同剂量下，ENU引起大鼠外周血RBCCD59-发生率升高效果优于CP，且40 mg/kg剂量优于10 mg/kg剂量，检验周期以28 d为宜。

ENU和CP作为常用烷化剂类致突变诱变剂，可直接与DNA发生交叉联结，干扰DNA和RNA功能，进而导致基因突变。ENU引起外周血红细胞表面蛋白CD59缺失率高于CP，猜想可能是ENU和CP对造血干细胞和有限自我更新能力的定向细胞的影响程度不同[9]。ENU是常用的有效的致突变剂，大量的文献报道其可引起Pig-a基因突变发生率的增加[2,7,9-10]，我们的试验结果也验证了这一结果。CP作为常用的遗传毒性试验阳性物，Kimoto等[8]研究发现，连续10 d给予大鼠5 mg/kg剂量的CP，外周血RBCCD59-未见统计学差异，而Walker等[11]研究发现给予大鼠20 mg/kg的CP 8周后，外周血RBCCD59-是对照组的2～3倍，和我们的试验结果保持一致。但总的来说，CP引起外周血RBCCD59-效果并不明显，至少不会引起X染色体上Pig-a或者Hprt基因的明显突变。

但本试验不足之处在于，未能从多方面全面评价阳性致突变物引起的大鼠外周血Pig-a基因突变，后期试验可以增加对网织红细胞表面CD59缺失率，网织红细胞微核率等相关指标的研究[12]，采用多指标联合评价该方法灵敏度。

在本试验条件下，综合大鼠体重和外周血RBCCD59-发生率两个指标，我们得出ENU 40 mg/kg剂量引起大鼠外周血Pig-a基因突变的效果更优，采用流式细胞术方法，能够利用小样本量相对迅速地得到较为精确的结果，具有连续、动态监测等优点，该方法可以考虑应用到常规毒性研究中，用于化学物、化妆品等的急性、慢性暴露引起的遗传毒性筛查。

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