isthmin 1对斑马鱼胚胎汇聚延伸运动的影响

王 政，李金鹏，闫一芳，王 强

(1.中国科学院动物研究所，膜生物学国家重点实验室，北京 100101； 2.河北省安国中学，河北 保定 071200)

斑马鱼胚胎原肠期是一个重要发育时期，胚胎经历一系列复杂的事件如细胞分裂、细胞运动(迁移和重排)、胚层诱导、背腹分化等建立个体的雏形。在原肠期，胚胎细胞进行包括外包，内卷和汇聚延伸运动在内的大规模的、协调一致的形态发生运动，促进胚胎胚层的形成和空间上的分离，确立了胚胎的体轴，为胚胎进一步发育勾勒出蓝图[1-2]。其中，独立且同时进行的汇聚和延伸运动对于胚胎的形态发生起关键作用。汇聚运动指的是上胚层和下胚层细胞向预定的胚胎背部区域迁移，进而引起中轴-侧轴方向变窄，而延伸运动是指背部细胞沿着前后轴伸展变长[1-2]。随着汇聚延伸运动的进行，原本位于胚胎腹部及侧边和边缘区域的细胞向背部汇集，从而在胚胎背部形成加厚的结构，称为胚盾[3]。同时，轴向和轴旁的细胞也发生重排和迁移，使得背腹轴变窄，沿前后轴发生延伸[4]。随着汇聚延伸运动的进行，胚胎的形状发生改变，预定发育成脊索、体节以及神经板的细胞也会向背部迁移[3]。自从Wilson在1991年通过爪蟾细胞移植实验观察到汇聚和延伸运动以来[5]，人们对汇聚延伸运动的作用有了更加深入的了解，但其调控机制还没有得到清晰的阐释。

Ism蛋白是新型分泌蛋白家族的成员[6]，包含保守的血小板反应蛋白I型重复结构域(thrombospondin type 1 repeats domain, TSRs domain)和AMOP(adhesion-associated domain in MUC4 and other proteins)结构域，在人类和小鼠内均有很强的保守性[7]。Ism基因首先在爪蟾中被鉴定出来，表达在胚胎腹部胚孔唇，脊索和中后脑边界等区域[7-8]。在斑马鱼中，ism有两个同源基因，分别是ism1和ism2。ism2特异表达在斑马鱼胚胎耳泡中，表明其没有参与胚胎原肠作用。近些年来，研究发现ism1是一个Nodal信号通路调控基因，与很多Nodal信号相关基因如squint、lefty1、lefty2、mixer等共表达[8-11]，但其在胚胎发育中的功能还不清楚。近来，我们通过流式细胞分选技术在30%外包期的Tg(gsc:GFP)转基因鱼胚胎中分离富集了背部GFP阳性细胞，并进行了RNA深度测序，鉴定了一批特异在胚胎背部表达的基因，其中就包括ism1[12]。在本研究中，我们发现ism1是合子表达的基因，30% 外包时期表达于胚胎背部，原肠期表达在整个胚胎边缘区。进一步的研究表明，过表达或敲低ism1均抑制了胚胎的汇聚延伸运动。因此，ism1参与了对胚胎原肠期汇聚延伸运动的调控。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用到的野生型斑马鱼胚胎均为Tuebingen品系；胚胎在Holtfreter水(3.5 g/L NaCl，0.05 g/L KCl，0.25 g/L NaHCO3，0.1 g/L CaCl2，pH 7.0)中，28.5℃恒温培养。

Morpholino(简称MO)是根据碱基互补配对原则设计、吗啉环修饰的反义寡核苷酸类似物。MO可以通过碱基互补配对的方式与mRNA分子结合，干扰mRNA的正常剪切(splicing MO)或者抑制其翻译(ATG MO)，最终降低特定基因的表达[13]。本研究使用的是ism1 ATG MO，序列为5’-CTCCGCC GCCAGACGCACCATCCTC-3’，由Gene Tools 公司设计并合成。

1.2 主要试剂及仪器

DNA快速纯化回收试剂盒(EP101，TIANG EN)；mMessage mMachine mRNA转录合成试剂盒(AM1344， Ambion)；RNA纯化试剂盒(DP412，TIANGEN)；MEGAscript原位杂交探针体外转录试剂盒(AM1330，Ambion)。

1.3 实验方法

1.3.1 整胚原位杂交

胚胎成长至所需时期，4%多聚甲醛固定24 h后剥膜过度到无水甲醇中脱水，于-20℃保存。原位杂交开始时，所有试剂及耗材均需DEPC处理，先梯度过渡到室温PBST中复水，每次5 min；随后置换成100% PBST，放置5 min且重复一次。随后在杂交液里进行预杂交2 h以上，再加入相应RNA探针，65℃杂交过夜。随后，65℃杂交缓冲液洗涤胚胎，然后杂交阻断液室温封闭1 h。SSCT洗脱，抗地高辛抗体孵育过夜，MABT洗脱， NBT/BCIP显色。样品4℃保存于 90%甘油中。

1.3.2 mRNA的合成及原位杂交RNA探针的制备

限制性内切酶Not I将质粒DNA线性化，酶切过夜，再使用DNA快速纯化回收试剂盒回收线性化的DNA模板。然后用mMessage mMachine 试剂盒体外转录合成mRNA。最后利用RNA纯化试剂盒纯化回收mRNA，以无核酸酶水溶解，使用分光光度计测定得到的mRNA的浓度，分装后于-80℃保存。

使用MEGAscript试剂盒体外转录合成地高辛标记的原位杂交RNA探针，然后通过RNA纯化试剂盒纯化回收，-20℃保存。

1.3.3 拍照

本研究中活体拍照均在2%甲基纤维素中固定拍照；原位杂交的胚胎用90%的甘油通透后，Leica M165C体视显微镜进行拍照。

2 结果

2.1 ism1在斑马鱼原肠期胚胎胚盘边缘表达

注：A：128细胞期；B：半球期；C和C’：30%外包期；D和D’：胚盾期；E：75%外包期；F：尾芽期；G和G’：24 h期；H和H’：36小时期；A～F为侧面观，动物极向上；C’和D’ 为动物极观，背部在右；G和H为侧面观，背部向上；G’和H’为背部观。图1 ism1在斑马鱼胚胎的时空表达图谱Note.A, 128-cell stage. B, Sphere stage. C and C’, 30% epiboly stage. D and D’, Shield stage. E, 75% epiboly stage. F, Bud stage. G and G’, 24 h stage. H and H’, 36 h stage. Embryos in penal A to F were shown in lateral views with the animal pole at the top, while embryos in penal C’ and D’ were shown in animal views with dorsal to the right. Embryos in penal G and H were shown in lateral views with the dorsal to the top, while embryos in penal G’ and H’ were shown in dorsal views.Fig.1 Temporal and spatial expression pattern of ism1

基因在胚胎发育中的时空表达图谱，对于揭示其潜在的发育生物学功能具有重要的作用。因此，我们首先通过整胚原位杂交技术检测了ism1在斑马鱼胚胎早期发育中的表达。实验结果表明，在30% 外包时期之前，没有检测到ism1的表达(图1 A和1B)，说明ism1不是一个母源基因。在30% 外包时期，ism1开始表达于胚胎背部预定胚盾部位(图1C和1C’)。在胚盾时期，可观测到ism1表达在整个胚胎边缘区，尤其在胚盾部位有较强表达(图1D和1D’)。在75%外包和尾芽期，ism1主要表达在前体节中胚层(presomitic mesoderm)(图1E和1F)，而24 h和36 h则主要表达在中后脑边界和尾部脊索区域(图1G～1H’)。因此，ism1是一个表达于胚胎早期发育时期的合子基因，在原肠期特异表达在胚盘边缘。

2.2 过表达ism1引起汇聚延伸运动缺陷

注：A～C：单细胞时期注射200 pg ism1 mRNA后，活体拍照观察过表达ism1后胚胎的表型；A:胚盾期；B和C：24 h期；C为B的放大版图；A为侧面观，胚盾在右侧；B为背部朝上侧面拍照；C是为头部腹侧观特写；D～F：ism1过表达后原位杂交检测标记基因表达水平的变化；D是papc的尾部观，腹部向上；E是ntla的背部观，头部向上；F左侧是myod1的尾部观，腹部向上；F右侧是myod1的背部观，头部向上。图2 ism1过表达影响胚胎汇聚延伸运动Note.A, ism1-overexpressed embryos showed CE movement defects compared with the uninjected control, after 200 pg ism1 mRNA was injected at the one-cell stage. The stages were indicated; Figure C images were presented at a higher magnification in the corresponding Figure B images. A, shield-stage embryos were shown in lateral views with the animal pole at the top. B, lateral views with the dorsal to the top; C, embryos were viewed ventrally with anterior to the left. D to F, Expression patterns of marker genes in control and ism1-overexpressed embryos at the tailbud and 10 ss stages. D, posterior views with the ventral at the top; E, dorsal view with head at the top; The left panel in Figure F, posterior views with the ventral at the top. The right panel in Figure F, dorsal view with head at the top.Fig.2 Over-expression of ism1 leads to severe defects of convergence and extension (CE) movements

原肠作用中的汇聚延伸运动是胚胎内多细胞协同定向迁移，处于迁移前沿，即胚盘边缘的细胞在调控汇聚延伸运动中发挥着主导作用。ism1在原肠期胚盘边缘区域的表达，提示其可能参与了胚胎的汇聚延伸运动。因此，我们首先检测了过表达ism1对胚胎汇聚延伸运动的影响。我们体外合成了ism1 mRNA，并在单细胞时期显微注射至斑马鱼胚胎中。结果表明，在胚盾期，与野生型胚胎相比，注射200 pgism1 mRNA的胚胎腹侧细胞较多，而背侧胚盾不能形成，说明过表达ism1抑制了腹部细胞向背部区域的迁移(图2 A)。在受精后24 h(hours post fertilization, hpf)，过表达ism1的胚胎前后轴明显变短(图2B)，而且眼睛融合在一起，形成独眼的表型(图2C)。这些现象均为汇聚延伸运动缺陷的特征[14]。另外，我们还进一步通过原位杂交技术检测了汇聚延伸运动相关基因表达图式的变化。研究发现，过表达ism1迟滞了轴旁中胚层(papc)向体轴中线的迁移(图2D)，并导致轴向中胚层(ntla)沿前后轴向变短、沿背腹轴向变宽(图2E)。进一步的结果揭示，过表达ism1还引起体节(myod1)生成的类似缺陷(图2F)。因此，ism1过表达干扰了斑马鱼胚胎汇聚延伸运动。

2.3 敲降ism1同样导致胚胎汇聚延伸运动缺陷

注：A：活体拍照观察敲降ism1(2 ng ism1 MO)后胚胎的表型，胚胎在24 h观察拍照，侧面观背部向上；B：原位杂交检测敲降ism1后标记基因的变化。MO注射引起的缺陷可以被ism1 mRNA特异性地拯救。标记基因从左到右依次是papc、ntla和myod1。尾牙期的papc为尾部观，腹部向上；尾牙期的ntla是背部观，头部向上；左侧是尾牙期的myod1的尾部观，腹部向上；右侧是10体节的myod1的背部观，头部向上。图3 敲降ism1引起汇聚延伸运动缺陷Note.A: Morphological characterization of ism1 morphants, the eye spaces were narrowed in ism1 morphants, lateral view were shown, with dorsal side to the top. The numbers indicated in the lower lefthand corner of each picture are the number (left) of affected embryos with phenotype similar to what is shown in the picture and the total number (right) of observed embryos. B: The expression patterns of papc, ntla, and myod1 in ism1 morphants and control embryos at the tailbud (10 hpf) and 6 somite stages. Injection of ism1 mRNA could rescue CE defects of ism1 morphants. papc, posterior views with the ventral at the top; ntla, and dorsal view with head at the top. The left panel of myod1, posterior views with the ventral at the top. The right panel of myod1, dorsal view with head at the top.Fig.3 ism1-knockout leads to ism1-deficient embryos exhibiting severe CE defects

为了探讨内源性Ism1在胚胎汇聚延伸运动中的功能，我们在单细胞时期，将2 ngism1 MO注射到斑马鱼胚胎中，抑制ism1的表达。在胚盾期，与过表达ism1的胚胎不同，注射ism1 MO的胚胎背侧胚盾没有明显缺陷，可能是由于内源性Ism1表达较晚，不参与胚盾的形成。在受精后24 h，与野生型胚胎相比，注射ism1 MO的胚胎前后轴变短，体节由正常的“V”字形变为“U”字形(图3 A)，类似于以前报导的汇聚延伸运动缺陷[15]。为了进一步证明ism1的功能，我们检测了汇聚延伸运动相关的基因表达。在注射ism1 MO的胚胎中，与过表达ism1类似，轴旁中胚层(papc)、轴向中胚层(ntla)和体节(myod1)同样呈现了前后轴向变短、背腹轴向变宽的特征(图3B)。为了排除注射ism1 MO可能引起的对其他基因的非特异性抑制，我们将ism1 mRNA与ism1-MO共同注射，来检测ism1 mRNA对汇聚延伸运动缺陷的拯救作用。如图3B所示，通过检测papc,ntal和myod1的表达，表明注射200 pgism1 mRNA可以较好的拯救ism1功能缺失引起的汇聚延伸运动缺陷。以上结果充分表明，ism1对斑马鱼胚胎的汇聚延伸运动是必需的。

3 讨论

本研究以斑马鱼为模式动物，发现ism1是一个合子表达基因，在原肠期及其之前就开始表达，是维持斑马鱼的汇聚延伸运动所必需的。近年来的研究表明，Ism是一种分泌型蛋白，通过和血管内皮细胞膜上的αvβ5整合素蛋白结合，稳定细胞间的连接，干扰VEGF诱导的内皮细胞增殖并触发细胞凋亡，抑制血管新生，从而起到抗肿瘤作用[9,16]。另外，Ism高表达于小鼠肺部血管内皮细胞，结合另一种膜表面受体GRP78，从而增强GRP78对胞内Src的招募并激活其激酶活性，促进内皮细胞凋亡，诱发肺部血管血液渗漏[17]。在斑马鱼早期胚胎发育过程中，ism1与squint,lefty1,lefty2,mixer等具有类似的表达图式，且其表达受到Nodal信号调控[4, 9]。我们以前的研究结果揭示，Nodal信号通过其下游的mir-206调控胚胎的汇聚延伸运动[1-2]。Ism1是否可以通过结合Nodal受体蛋白调控Nodal信号活性，在胚胎汇聚延伸运动中发挥作用，还有待于进一步的研究。

多个研究表明，胚胎的汇聚延伸运动必需受到严密的调控，相关信号通路的过度激活或抑制，以及相关基因的过表达或失活，均致使胚胎发生汇聚延伸运动缺陷[1, 2, 15]。我们的研究结果显示，过表达或敲降ism1同样抑制了胚胎汇聚延伸运动。由于Ism1是一种分泌型蛋白，我们推测其对汇聚延伸运动的影响可能是非细胞自主性的。综上所述，我们的研究阐明了ism1在斑马鱼胚胎汇聚延伸运动中的功能，将有助于增加我们对相关发育事件调控机制的理解。

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