利用苹果皮渣发酵制备天然酵素工艺优化及其对苹果品质的影响

2018-03-05郭俊花许先猛王晓东李赈群

江苏农业科学 2018年1期

郭俊花，许先猛，马欣，王晓东，李赈群

(运城职业技术学院有机食品工程系，山西运城 044000)

微生物酵素是指以1种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、中草药等为原料，经多种有益菌发酵而产生，含有丰富微生物、酶、矿物质和次生代谢产物等营养成分的功能性微生物发酵产品[1]。酵素菌是一种微生物，又被称为农用酵素(BYM)，早在20世纪40年代由日本的岛本觉发明，并在农业生产中发挥了重要作用[2]，而酵素菌肥可以改善土壤理化性质，提高土壤供肥能力，又可以抑制有害病菌，促进作物早熟，改善果树树体营养，提高水果的产量和质量[3]。目前，对果蔬酵素的研究主要是优化发酵工艺、功能性成分研究等方面[4-7]，且主要强调酵素在食用、保健方面的突出功效，果蔬酵素对种植业的功效研究较少。

苹果是我国的第一大水果，2016年产量达5 400万t，占世界总产量的50%以上，其中约有20%用于工业化深加工，每年将产生数以万吨的苹果渣，而这些苹果渣除少量用作燃料、饲料和提取果胶外，大部分被当做垃圾处理，造成资源极大浪费[8]。本试验以苹果果脯加工企业生产过程中的下脚料——苹果皮渣为原料，利用果皮本身含有的天然有益微生物进行苹果皮渣酵素制备，并将苹果皮渣酵素运用在有机苹果的种植过程中，研究酵素对苹果生长过程果实品质的影响，以提高苹果皮渣的利用价值，减少巨大的资源浪费，并能为苹果产业的发展另辟蹊径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料苹果皮渣，由山西泽源食品有限公司提供。

1.1.2 试剂纯度98%的没食子酸标准品，由贵州遵义佳宏化工有限公司生产；福林酚试剂、芸香苷标准品，为美国Sigma公司产品；抗坏血酸标准品，由上海谷研生物化学研究所生产；氢氧化钠、无水碳酸钠、硝酸铝、亚硝酸钠、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、草酸、2，6-二氯靛酚、碳酸氢钠、亚铁氰化钾、亚甲基蓝、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，均为分析纯，市购。

1.1.3 仪器 JJ-2组织捣碎匀浆机，江苏常州国华电器有限公司生产；JY92-Ⅱ超声细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司生产；1/1 000 g BSA323S电子分析天平，德国赛多利斯公司生产；3K15高速冷冻离心机，德国Sigma公司生产；FE20K pH计，瑞士梅特勒托利多公司生产；WYT-32ATC手持糖度折光仪，福建泉州仪器有限公司生产；游标卡尺0～150 mm，上海量具刃具厂生产；GY-B硬度计，吉林四平机械设备公司生产；SX2-4-10马福炉，北京科伟仪器有限公司生产；754紫外分光光度计、722N可见分光光度计，上海菁华仪器有限公司生产；1 000 W万用电炉，天津泰斯特仪器有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果皮渣酵素发酵工艺将苹果皮渣打浆，用超声波400 W处理10 min；红糖用紫外线杀菌45 min，用无菌水溶解，置于已灭菌的玻璃瓶中，加入苹果皮渣，搅拌均匀，用苹果醋调节发酵液pH值至合适值；封口，放于暗处，15～25 ℃下发酵[9]。

1.2.2 苹果皮渣酵素发酵的单因素试验设计

1.2.2.1 苹果皮渣量分别取100、200、300、400、500 g苹果皮渣，打浆，超声波处理；分别取90 g红糖溶解于1 000 mL无菌水中，置于已灭菌的玻璃瓶中，并加入苹果皮渣，搅拌均匀，用苹果醋调节初始pH值至5.0；封口，放于暗处，15～25 ℃下发酵150 d；测定苹果皮渣酵素的酵素超氧化物歧化酶(SOD)活性和总酸含量。

1.2.2.2 加糖量取300 g苹果皮渣，打浆，超声波处理；分别取30、60、90、120、150 g红糖溶解于1 000 mL无菌水中，置于已灭菌的玻璃瓶中，加入苹果皮渣，搅拌均匀，用苹果醋调节初始pH值至5.0；封口，放于暗处，15～25 ℃下发酵150 d；测定苹果皮渣酵素的SOD活性和总酸含量。

1.2.2.3 初始pH值取300 g苹果皮渣，打浆，超声波处理；分别取90 g红糖溶解于1 000 mL无菌水中，置于已灭菌的玻璃瓶中，加入苹果皮渣，搅拌均匀，分别用苹果醋调节初始pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；封口，放于暗处，15～25 ℃下发酵150 d；测定苹果皮渣酵素的SOD活性和总酸含量。

1.2.2.4 发酵时间取300 g苹果皮渣，打浆，超声波处理；分别取90 g红糖溶解于1 000 mL无菌水中，置于已灭菌的玻璃瓶中，加入苹果皮渣，搅拌均匀，分别用苹果醋调节初始pH值至5.0；封口，放于暗处，15～25 ℃下分别发酵90、120、150、180、210 d；测定苹果皮渣酵素的SOD活性和总酸含量。

1.2.3 苹果皮渣酵素发酵正交试验设计在单因素试验的基础上，以苹果皮渣添加量、红糖添加量、初始pH值、发酵时间为自变量因素，以SOD活性和总酸含量为评价指标，进行L9(34)正交试验，以确定苹果皮渣酵素的最佳发酵工艺条件(表1)。

表1 苹果皮渣酵素发酵正交试验因素水平设计

1.2.4 苹果皮渣酵素对红富士苹果生长过程中果实品质的影响以山西省运城市临猗县孙吉有机果园为试验点，选择树势均匀一致、果园土壤差异相对较小、栽培措施基本一致的10年生红富士苹果树为试验对象，选择10株于当年9月26日，次年3月28日、5月2日分别施入5、2、2 kg/株苹果渣酵素，另选10株不施苹果渣酵素作为对照。果树生长期间不进行其他施肥管理。苹果生长过程中，测定2个处理的总酸、可溶性固形物含量及固酸比、硬度，6月15日进行第1次采样，后每隔14 d采样1次，直至果实成熟，其中苹果成熟期还另测定果实的单果质量、果形指数、总灰分、维生素C含量、蛋白质含量、还原糖含量、水解后还原糖含量、多酚含量及黄酮含量。每次随机抽取10个果实，重复3次。

1.2.5 测定方法分别采用邻苯三酚自氧化法、福林酚法、硝酸铝络合分光光度法测定SOD活性、多酚含量、黄酮含量[10-13]；分别采用手持糖度折光仪、GY-B硬度计、游标卡尺、精度为千分之一的电子天平测定果实可溶性固形物含量、硬度、果实纵径和横径、单果质量；分别参照标准《食品中总酸的测定》(GB/T 12456—2008)、《食品中灰分的测定》(GB 5009.4—2016)、《食品中抗坏血酸的测定》(GB 5009.86—2016)、《食品中蛋白质的测定》(GB 5009.5—2010)、《食品中还原糖的测定》(GB 5009.7—2016)、《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》(GB 5009.8—2008)测定总酸(可滴定酸)含量、总灰分、维生素C含量、蛋白质含量、还原糖含量及水解后还原糖含量。固酸比为可溶性固形物含量与总酸含量的比值，果形指数为果实纵径和横径之比。

2 结果与分析

2.1 苹果皮渣酵素发酵单因素试验

2.1.1 苹果皮渣添加量的确定苹果皮表面含有大量的天然微生物菌群，可为酵素发酵提供酵母菌、醋酸菌等必需的微生物。由图1可见，随着苹果皮渣添加量的增加，发酵液中有益微生物数量增加，从而使发酵液中SOD活性和总酸含量均呈上升趋势；当苹果皮渣添加量为100～300 g/L时，SOD活性和总酸含量增加相对较快，继续增加苹果皮渣量，SOD活性和总酸含量上升趋势缓慢，故选择最佳苹果皮渣添加量为300 g/L。

2.1.2 红糖添加量的确定红糖可为发酵液中的有益菌群提供充足的碳源，使有益生物菌群大量繁殖，并产生大量的代谢产物，考察红糖添加量可为微生物的生长代谢确定合适的碳源量。由图2可见，当红糖添加量为90 g/L时，SOD活性达到最大值，此时总酸含量为3.9 g/L，且随红糖添加量的增加，总酸含量变化不大。故选择最佳加糖量为90 g/L。

2.1.3 初始pH值的确定将苹果醋加入到发酵液中，既可以调节发酵液的pH值，使其呈弱酸性，有效抑制有害菌群的繁殖，又可以抑制乙醇的产生，有利于耐酸性酶的产生与活性保持，为有益菌群的大量繁殖提供条件[9]。由图3可见，初始pH值对酵素的总酸含量和SOD活性有较大影响，初始pH值调至5.0时，二者达到最大值。故确定最佳初始pH值为 5.0。

2.1.4 发酵时间的确定由图4可见，发酵前120 d内，由于微生物的大量繁殖代谢，总酸含量和SOD活性有明显上升，发酵150 d时总酸含量和SOD活性达到最大值，之后随着发酵时间的延长，微生物代谢活动逐渐减弱，总酸含量和SOD活性略有下降。因此，选择最适发酵时间为150 d。

2.2 苹果皮渣酵素发酵正交试验

由表2可见，影响苹果皮渣酵素总酸含量的因素主次顺序为B>A>D>C，即加糖量对总酸含量有很大影响，是主要控制因素，其次是苹果添加量，最优发酵组合为B2A3D2C3；影响苹果皮渣酵素中SOD活性的因素主次顺序为B>A>C>D，最优组合也为B2A3D2C3。因此，确定最佳发酵工艺为苹果皮渣添加量400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH值5.5、发酵时间150 d。经测定，在优化条件下酵素总酸含量为 3.96 g/L，SOD活性为66.2 U/mL。

2.3 苹果皮渣酵素对富士苹果品质的影响

2.3.1 苹果皮渣酵素对富士苹果生长过程中果实品质的影响

2.3.1.1 可溶性固形物可溶性固形物含量是果实重要的品质性状之一，其含量高低对果实营养价值、风味口感、实质产量等方面有重要影响，并对果实储藏、运输过程中的防冻等有重要影响[14]。由图5可知，在生长期间，施入酵素和未施酵素(对照)苹果果实的可溶性固形物含量呈明显上升趋势；对照处理的苹果可溶性固形物含量低于酵素处理；生长前期，2个处理的可溶性固形物含量相差较小，8月10日后2个处理的果实可溶性固形物含量差距增加，苹果皮渣酵素的施用明显提高了苹果生长后期的可溶性固形物含量，从而明显改善了苹果的风味及品质。果实中的酸含量也是影响果实品质的重要因素[14]。

2.3.1.2 总酸含量由图6可见，在生长期间，施入酵素的苹果总酸含量变化趋势与未施入酵素相似，呈逐渐下降趋势，同一时期施入酵素的苹果总酸含量高于对照，说明施入酵素可促进苹果果实中有机酸的积累；6月15日至7月13日，2个处理的总酸含量缓慢下降，7月27日后总酸含量下降迅速。

表2 苹果皮渣酵素发酵正交试验结果

注：k1、k2、k3、R为总酸对应数值；k1′、k2′、k3′、R′为SOD活性对应数值。

2.3.1.3 糖酸比苹果的风味品质主要取决于糖酸含量及其配比关系，高糖低酸的果实口感淡薄，低糖高酸的果实口感过酸，都不符合鲜食要求[15]。由图7可见，施入酵素的苹果与对照苹果相比，固酸比差异不大，仅在8月10日至9月21日之间施入酵素的苹果固酸比稍大，至成熟时二者固酸比又几乎相同。

2.3.1.4 果实硬度由图8可见，施入酵素和未施入酵素(对照)的苹果硬度均呈先上升后降低趋势，8月10日二者的硬度达到最大值；生长期间，对照苹果的硬度均低于酵素处理的苹果，说明施用酵素可提高苹果果实的硬度，从而进一步延长苹果的货架期。

2.3.2 苹果皮渣酵素对富士苹果成熟果实品质的影响由表3可见，施入酵素的苹果果形指数低于对照处理，相互间差异不显著(P>0.05)；除果形指数外，施入酵素的苹果其他指标均大于对照，其中总灰分、维生素C含量、水解后还原糖含量、果皮中多酚含量、果肉中黄酮含量与对照相比差异不显著(P>0.05)，单果质量、去皮硬度、总酸含量、蛋白质含量、果肉中多酚含量、果皮中黄酮含量与对照相比差异显著(P<0.05)，可溶性固形物、还原糖含量与对照相比差异极显著(P<0.01)。

表3 施入酵素对红富士苹果果实品质的影响

注：同列数据后标注“*”“**”分别表示处理间差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)。

3 结论与讨论

本试验以果脯制作过程中废弃的苹果皮渣为原料，利用苹果本身含有的天然有益微生物制备苹果皮渣酵素，通过单因素和正交试验表明，苹果皮渣酵素的最佳发酵条件为苹果渣添加量400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH值5.5、发酵时间150 d，此优化条件下酵素的总酸含量为3.96 g/L，SOD活性为66.2 U/mL。

有研究表明，总酸含量为2～5 g/kg、含糖量较高(可溶性固形物含量≥14.5%或总糖含量≥12.5%)、固酸比偏低(3.0～3.5)时的果实酸甜适宜，风味品质相对较好，优质率最高[15]。本试验结果表明，施入酵素成熟期的苹果总酸含量为5.7 g/kg、可溶性固形物含量为14.72%、固酸比为2.58，说明施用苹果皮渣酵素可以一定程度上提高红富士苹果的风味与品质，提高了苹果的优质率。

将制得的苹果皮渣酵素施用于有机红富士苹果园，考察施入苹果皮渣酵素对红富士苹果果实品质的影响发现，施入酵素的苹果在生长过程中可溶性固形物含量、总酸含量、硬度均高于未施入酵素的苹果(对照)，固酸比差别大不；苹果成熟期时，除果形指数外，单果质量、硬度、可溶性固形物含量、总酸含量、总灰分、维生素C含量、蛋白质含量、还原糖含量、水解后还原糖含量、多酚含量、黄酮含量等指标均高于对照，这可能是因为利用废弃苹果皮渣制备而成的酵素，一方面其含有的有机酸可以调节土壤pH值，丰富的有机物可以提高土壤有机质含量，进而提高土壤中各种微量元素的有效含量，另一方面，各种有益微生物及发酵后产生的各种酶能够迅速催化分解各种有机物，使之在短时间内转化为可供利用的成分，被果实吸收利用[3，16-18]，进一步促进苹果中各种营养和功能成分的积累，果实品质得到提升，也使废弃资源得到有效利用。在今后的研究中，还应对酵素对土壤养分含量的影响及有害病菌的抑制等方面进行深入探索，以更全面地了解酵素在苹果种植过程中的应用效果。

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