BBI阻断LPS对肠道上皮细胞间紧密连接蛋白的抑制作用

古 俊, 刘金彪, 霍文哲

(武汉大学基础医学院，湖北 武汉 430071)

肠道是人体最重要和最复杂的器官之一，它不仅为机体各个器官组织提供营养物质，也为微生物的生存提供必要的空间与营养条件。人类的许多疾病都伴有肠道功能紊乱以及菌群失调症状。因此，肠道的功能表现也是反映机体健康的直接和重要指标之一[1]。肠道上皮细胞在血液循环和肠道内的外环境间形成一道天然屏障，是阻挡肠道内微生物及其产物进入机体的第一道重要防线，对维持肠道内动态平衡和正常功能至关重要[2]。肠道上皮细胞能吸收对机体有益的物质，并特异性地排斥病原体等有害物质[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是一种感染性细菌(革兰阴性细菌)的产物，可诱导包括巨噬细胞在内的免疫细胞和非免疫细胞表达大量的炎症因子，引起炎症反应。LPS诱导产生的炎症因子会损伤肠道上皮屏障，改变屏障的通透性[4]。肠道内菌群紊乱以及肠道上皮屏障受损会导致LPS的移位，进入血液循环，进一步加剧炎症反应。在艾滋病等多种感染性疾病以及肠炎等非感染性疾病中，肠道免疫紊乱及肠道屏障破坏是主要的病理变化[5]。

包曼-毕尔克抑制剂(Bowan-Birk inhibitor，BBI)是一种大豆富含的耐酸性蛋白酶抑制剂，具有抗炎功效[6]。研究表明，BBI能有效抑制炎性因子表达，对免疫性疾病具有潜在的治疗功效[7-8]。BBI还能抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的表达，减少炎性巨噬细胞造成的神经损伤[9]。我们的前期研究[10]显示，BBI能激活巨噬细胞内天然免疫，抑制人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的感染和复制；BBI能抑制LPS诱导的肠道上皮细胞NF-κB激活，从而抑制炎症因子的表达。大量研究表明，肠道还是HIV感染的主要场所。HIV感染使肠道CD4+T细胞丢失，造成肠上皮屏障通透性增加，细菌及其产物如LPS进入血液循环，引起全身性免疫激活，这是HIV感染进展到艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的主要原因。因此，抑制或降低LPS诱导的免疫激活有助于减缓HIV疾病进展。在这项研究中，我们选择既有抗炎作用又能抑制HIV的天然产物BBI，研究BBI是否能阻断LPS对肠道上皮细胞间紧密连接蛋白的抑制作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 LPS购于美国InvivoGen公司，其效价为106EU/mg(endotoxin Unit/mg)，用无内毒素的水溶解LPS(10 μg/μL)后保存于-80℃；BBI购于美国Sigma-Aldrich公司，其纯度>90%，用高压灭菌双蒸水溶解BBI(10 mg/mL)后保存于-80℃；Tri-reagent购于美国Sigma-Aldrich公司；SsoAdvancedTM Universal Inhibitor-Tolerant SYBR○RGreen Supermix购于美国BIO RAD公司；CCK8试剂盒购于美国MCE公司。ZO-1兔单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，Occludin兔单克隆抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司，NF-κB和p-NF-κB兔单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养 HT-29细胞(人结肠癌上皮细胞系)购于ATCC细胞库。在37℃、5%CO2的细胞培养箱中，用DMEM完全培养基(含10%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%HEPES缓冲液)培养HT-29细胞。

1.3 毒性试验 用CCK8试剂盒检测LPS和/或BBI对HT-29细胞的毒性作用。在96孔细胞培养板中培养HT-29细胞(104个/孔)，12 h后用不同浓度的LPS(0、0.1、1、10、100、1 000 ng/mL)、BBI(0、25、50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL)或BBI预处理后再用LPS处理细胞72 h。在每个培养孔中加入10 μL CCK8溶液，继续培养4 h后，用全自动多功能酶标仪(在波长450 nm处)检测吸光度值。

1.4 荧光定量PCR 用Tri-Reagent提取细胞RNA，然后用NANDROP超微量分光光度计(Thermo Scientific)检测RNA浓度。根据说明书，用逆转录PCR试剂盒(Promega，USA)和随机引物(Promega，USA)对RNA进行逆转录， 37℃扩增1 h，95℃终止反应。实时荧光定量PCR用SYBR Green Supermix试剂盒。反应条件为95℃预变性1 min，95℃ 5 s→60℃ 10 s，40个循环。实验所使用引物见表1。Ct值相对GAPDH进行均一化，采用2-△△Ct法计算mRNA的表达水平。

1.5 蛋白质印迹法(Western Blot) 在6孔板中按2×106个/孔培养HT-29细胞。用RIPA中强度裂解液(碧云天生物技术公司)提取LPS或BBI处理过的细胞蛋白，RIPA中加入蛋白磷酸酶抑制剂(北京普利莱基因技术有限公司)。用8% SDS-PAGE胶分离40 μg总蛋白，然后转至PVDF膜(Biro Rad公司)，5%脱脂奶粉封闭，再用稀释的ZO-1兔单克隆抗体(1∶1 000)，Occludin兔单克隆抗体(1∶1 000)，NF-κB及p-NF-κB兔单克隆抗体(ser-536，1∶1 000)，4℃孵育过夜，充分洗涤后用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育3 h，洗涤后用增强型化学发光剂ECL(碧云天生物技术公司)在化学发光成像仪上显影。用Image J图像软件分析条带密度。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1 BBI和/或LPS对肠道上皮细胞的毒性作用 用CCK8试剂盒检测细胞活性，将未处理的细胞在波长490 nm处的吸光度值定为1.0，以此计算处理细胞和未处理细胞的百分比值，重复3次实验，每次实验的三个复孔取均数±标准差。用不同浓度LPS和/或BBI处理HT-29细胞72 h，处理的细胞和未处理细胞的活性相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1A。先用BBI预处理细胞6 h，再用不同浓度LPS处理细胞，处理的细胞和未处理细胞的活性相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1B。BBI最大浓度(1 000 μg/mL)和LPS最大浓度(1 000 ng/mL)，对细胞均无毒性作用。

A：用不同浓度LPS和/或BBI处理HT-29细胞72 h；B：用BBI预处理细胞6 h，再用不同浓度LPS继续处理72 h

2.2 BBI阻断LPS对肠道上皮细胞间紧密连接蛋白的抑制作用 提取细胞RNA，实时荧光定量PCR检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin以及GAPDH的mRNA水平表达，数据采用2-△△Ct法计算，重复3次实验，每次实验的三个复孔取均数±标准差。LPS可显著地下调HT-29细胞间紧密连接蛋白(ZO-1, Occludin)在mRNA和蛋白水平的表达，其下调作用与LPS浓度成正比。BBI预处理6 h 能抑制LPS对HT-29细胞紧密连接蛋白的下调作用，且这种抑制效应与BBI剂量成正相关。见图2。

2.3 BBI 对LPS诱导的肠道上皮细胞TLR4表达的影响 提取细胞总RNA，实时荧光定量PCR检测细胞TLR4以及GAPDH在mRNA水平的表达，数据采用2-△△Ct法计算，重复3次实验，每次实验的三个复孔取均数±标准差。LPS能显著上调HT-29细胞TLR4受体的表达，且上调作用具有时间和剂量效应。LPS处理HT-29细胞3 h时对TLR4mRNA水平的上调作用最明显，见图3A。在10 ng/mL浓度时，LPS对TLR4的诱导作用最强，见图3B。BBI预处理HT-29细胞6 h可明显抑制LPS对TLR4的上调作用，而且BBI的这种抑制作用具有剂量效应，见图3C。

A：按不同时间(0、3、6、12、24 h)用LPS(10 ng/mL)处理HT-29细胞，检测LPS对ZO-1和Occludin表达的影响；B：用不同浓度BBI预处理细胞6 h，再用LPS处理6 h，检测BBI对LPS的阻断作用；C：用不同浓度LPS处理HT-29细胞24 h；或用不同浓度BBI预处理细胞6 h，再用LPS处理24 h；Western Blot检测细胞ZO-1、Occludin以及内参β-actin蛋白水平表达；*：P<0.05；**：P<0.01

图2BBI阻断LPS对HT-29细胞紧密连接蛋白的抑制作用

Figure2BBI blocks LPS-mediated inhibitory effect on tight junction protein in HT-29 cells

A：按不同时间点(0、3、6、12、24 h)用LPS(10 ng/mL)处理HT-29细胞；B：用不同浓度的LPS处理HT-29细胞；C：用不同浓度BBI预处理细胞6 h，再用LPS(10 ng/mL)处理3 h；*：P<0.05；**：P<0.01

图3BBI阻断LPS对TLR4的作用

Figure3BBI blocks LPS-mediated effect on TLR4

2.4 BBI对肠道上皮细胞炎症因子、TLR4及MyD88表达的影响 用BBI(100 μg/mL)处理HT-29细胞，提取细胞RNA，用实时荧光定量PCR检测细胞TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、TLR4、MyD88以及GAPDH的mRNA表达，数据采用 2-△△Ct法计算，重复3次实验，每次实验的三个复孔取均数±标准差。高浓度BBI(100 μg/mL)处理HT-29细胞对炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1)、TLR4以及MyD88的表达无明显作用。BBI处理时间长短(3、6、12、24 h)对上皮细胞炎症因子表达也无影响(P>0.05)。见图4。

2.5 BBI对LPS诱导的肠道上皮细胞NF-κB活化的影响 用含蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞蛋白，Western Blot检测细胞磷酸化的N F-κB。LPS能显著地促进HT-29细胞内NF-κB的磷酸化，这种促NF-κB磷酸化的作用具有剂量效应。BBI对NF-κB的磷酸化无影响，而BBI预处理HT-29细胞6 h能明显阻断LPS对NF-κB的磷酸化的促进作用。见图5。

图4 BBI对HT-29细胞表达炎症因子、TLR4和MyD88的影响

A：用不同浓度LPS处理HT-29细胞30 min；B：用LPS(10 ng/mL)处理HT-29细胞后，按不同时间点(0、5、15、30、60、120 min)检测细胞NF-κB；C：用不同浓度BBI预处理细胞6 h后再用LPS(10 ng/mL)处理HT-29细胞30 min

图5BBI对LPS诱导肠道上皮细胞NF-κB的磷酸化的影响

Figure5Effect of BBI on LPS-mediated phosphorylation of NF-κB in the intestinal epithelial cells

3 讨论

肠道上皮细胞是肠道屏障的重要组成部分，肠道屏障对保护肠道不受病原微生物入侵至关重要，以肠道上皮屏障的通透性作为疾病防治靶标越来越受到重视[11-12]。研究表明，细菌内毒素LPS能通过TLR4受体募集MyDD8，激活NF-κB，诱导肠道上皮细胞表达包括TNF-α、IL-1β、IL-8在内的大量炎性因子，导致肠道上皮细胞通透性增加，屏障损伤[13-14]，导致肠道内微生物及其产物移位，进入血液循环，引起全身性免疫激活[15-16]。由于HIV感染的主要靶细胞是CD4+T细胞，免疫激活成为HIV感染进展主要促进因素。因此，维持肠道完整性至关重要。肠道上皮细胞通过紧密连接蛋白维持上皮屏障的稳定[17]。Occludin是第一个被发现的细胞间紧密连接蛋白，表达于所有上皮细胞，在上皮屏障细胞结构和功能中均发挥重要作用[18]。ZO-1是细胞间带状紧密连接蛋白，是上皮细胞结构和功能的主要标志[19-20]。本研究显示，LPS处理肠道上皮细胞能明显地降低紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达。此外，LPS还能诱导肠道上皮细胞表达TLR4，有利于LPS发挥功效。LPS能激活肠道上皮细胞NF-κB，促进炎症因子表达。然而，BBI预处理能阻断LPS对细胞间紧密连接蛋白的抑制作用，BBI还能抑制LPS诱导的TLR4表达和NF-κB活化。这些结果为BBI对LPS的抑制作用提供了合理的解释。

LPS诱导产生的炎性因子是导致肠道屏障损伤及免疫激活的主要因素。机体免疫激活及肠道LPS移位促进HIV-1疾病进展。新近研究显示，LPS增加肠道上皮细胞通透性，损伤肠道屏障。由于紧密连接蛋白(ZO-1，Occludin)是形成细胞间空隙、控制肠道内物质进入体内的重要蛋白，抑制其表达会造成肠上皮屏障通透性增加，细菌及其产物如LPS进入血液循环，进一步加剧炎症反应，使HIV有更多靶细胞。因此，本研究结果表明，BBI能保护肠道上皮细胞不受LPS介导的炎性损伤，有利于降低和减缓HIV感染的进展。

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