人巨细胞病毒UL133基因型在婴幼儿肝功能损伤中的分子机制

温正旺 陈敏 陈洁 石海矾 蔡晓红 陈益平

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一种引起婴幼儿肝炎最常见的病原体[1]。HCMV肝炎占婴幼儿肝炎综合征的30%～40%或更高，临床表现多样（无症状的感染、胆汁淤积型肝炎甚至胆道闭锁），尤其是亚临床型肝炎最为常见，严重危害婴幼儿的生命与健康。人群普遍感染HCMV，其特异性IgG抗体阳性率可高达90%[2]。国内流行病学调查发现，婴幼儿HCMVIgG抗体阳性率为70%～90%[3]。为何有些婴幼儿HCMV感染会导致HCMV肝炎呢？既往研究提示HCMV中含有数百个基因型，其中UL133基因型与婴幼儿HCMV肝炎密切相关，但其具体的病理、生理机制尚不明确。本课题通过筛查HCMV肝炎患儿中病毒是否含有UL133基因型，并检测血液中肝细胞损伤相关蛋白的表达，来探索HCMV UL133基因型对婴幼儿肝功能损伤的分子机制。现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2016年1至12月本院收治的68例HCMV肝炎患儿和66例同期门诊体检肝功能正常且确诊HCMV感染（尿液中可检出HCMV包涵体）的患儿为研究对象。肝炎患儿中男38例，女30例；年龄（8.35±3.6）个月。体检患儿中男34例，女32例；年龄（8.36±2.7）个月。肝炎患儿与体检患儿性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究通过医院伦理委员会审批，且患儿家属知情同意。

1.2 尿液HCMV DNA的检测 留取患儿尿液10ml，利用PCR扩增结合测序以及原位杂交技术，明确患儿尿液HCMV是否存在UL133基因型。RT-PCR引物购自上海基康生物工程有限公司。

1.3 血液 Caspase-3、Caspase-6蛋白表达的检测Caspase-3和Caspase-6ELISA试剂盒购自美国Pepro－Tech公司；Caspase-3抗体、Caspase-6抗体购自英国Abcom公司。抽取患儿血液3ml，采用ELISA法检测。向预先包被了Caspase-3、Caspase-6单克隆抗体的酶标孔中加入Caspase-3、Caspase-6，温育；加入生物素标记的Caspase-3抗体、Caspase-6抗体，与链霉亲和素-HRP结合形成免疫复合物，温育，洗涤；去除未结合的酶，加入底物A、B，产生蓝色；在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色深浅与Caspase-3、Caspase-6蛋白浓度有关，根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

1.4 观察指标 观察并比较患儿尿液中HCMV UL133基因型，血液中Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平及肝功能指标。

1.5 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料用率表示，组间比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UL133基因型筛查结果 肝炎患儿尿液中UL133基因型筛查阳性率达94.1%，明显高于体检患儿的3.0%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。其中UL133基因型筛查阳性的64例肝炎患儿为UL133阳性组，UL133基因型筛查阴性的64例体检患儿为UL133阴性组。

表1 UL133基因型筛查结果

2.2 两组患儿血液中Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平比较 UL133阳性组患儿血液中Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平均明显高于UL133阴性组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组患儿血液中Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平比较

2.3 两组患儿肝功能指标比较 两组患儿血AST、TBiL、DBiL、谷氨酰转移酶（GGT）比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；UL133阳性组患儿血ALT明显高于UL133阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组患儿肝功能指标比较

3 讨论

HCMV属于疱疹病毒β亚科，是一种广泛分布的机会致病性病毒，具有潜伏活动的生物学特点。HCMV的自身DNA系列中含有免疫逃避基因，其基因组中含有人细胞因子及细胞因子受体的类似基因，可表达人细胞因子及细胞因子受体的类似物，从而干扰宿主自身的细胞因子系统；也能影响免疫系统，特别是抗原呈递细胞的抗原呈递功能，即通过下调人类白细抗原I的表达致使T细胞对抗原肽分子的识别受到抑制，同时CD4分子的共受体也相应受损，第一信号传导障碍，抑制T细胞激活，从而逃避机体免疫系统的攻击。HCMV感染可引起机体宿主细胞发生凋亡，而HCMV具有许多抗凋亡的机制和细胞毒性T细胞杀伤机制，使感染细胞长期存活；以上方式相互作用，使病毒感染后处于静息平衡状态；当机体免疫功能低下时，潜伏在体内的HCMV可激活，病毒大量复制，发生显性感染。在临床上，当HCMV感染肝细胞时，一部分患儿出现肝功能受损，表现为亚临床型肝炎、黄疸型肝炎、无黄疸型肝炎、胆汁淤积型肝炎、胆汁淤积症等，大部分患儿仅提示存在HCMV感染；同样一种病毒感染，肝炎患儿并未表现出具有明显差异的免疫功能损伤及低下，但临床症状却差异很大。HCMV感染可导致全身各系统组织器官发生损伤，但关于HCMV感染导致婴幼儿长期黄疸的研究中，通过组织活检以及免疫染色法，发现HCMV只存在于肝脏中，其他组织免疫染色都呈阴性[4]；且同一器官中，HCMV的靶细胞也存在特异性，即在HCMV肝炎中，HCMV主要感染肝细胞、血管内皮细胞及胆管上皮细胞，其他细胞中则检测不出HCMV包涵体。因此，笔者提出一种假设，即HCMV基因系列中存在一些病毒亲嗜性基因，以促进HCMV入侵肝细胞，从而导致HCMV肝炎的发生。因此，HCMV基因多态性的研究将有效揭示HCMV肝炎的肝损伤机制。

在人HCMV老鼠实验模型中，对人HCMV UL/b′区基因片段功能进行分析，发现部分该区基因片段的丢失可导致病毒毒力的改变[5]；此外，HDAXX蛋白可以抑制HCMV即早基因的表达和病毒复制，但当HCMV UL82毒株感染机体后，分泌PP71蛋白，会减轻HDAXX的抑制作用[5]。研究发现UL83基因型对脑组织血管平滑肌AT受体的表达水平影响很大，它可以促进AT1受体的表达，同时抑制AT2受体[6]。某肝癌研究发现，HCMV感染后可以激活IL-6R-JAK-STAT3信号通路，同时促进肝癌细胞的增殖，提示HCMV感染参与了肝癌细胞内的基因表达[7]。Guo等[8]研究证实HCMV β区UL144、UL146基因型与新生儿肝功能损伤密切相关，揭示β区基因型在HCMV肝损害中起重要作用。Petrucelli等[9]研究提示HCMV β区UL133基因型与HCMV的侵袭能力有关，可能与HCMV肝炎的发生、发展密切相关，但具体分子机制尚未完全阐明。因此，本课题研究重点仍是HCMV β区UL133基因型，拟通过检测血清中Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平，进一步探索UL133基因型与肝功能损伤的潜在分子机制，为HCMV肝炎的诊断与治疗提供一个新的靶点。

对HCMV肝炎患儿尿液进行筛查发现，所感染的HCMV普遍携带UL133基因型；进一步检测血清Caspase-3、Caspase-6蛋白表达，发现UL133阳性组与阴性组患儿的蛋白表达水平均明显上调。然而，在体检发现HCMV感染的患儿中，只有2例含有UL133基因型。此外，UL133阳性组患儿血液Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平均明显高于UL133阴性组组。既往研究表明肝炎患者Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平上调可直接诱导细胞凋亡，从而导致肝功能损伤[10-11]。值得注意的是，UL133阳性组与阴性组除血ALT外，AST、TBiL、DBiL、GGT 比较差异均无统计学意义；但是个别肝炎患儿血TBiL是存在升高的，部分患儿存在肉眼黄疸；以上结果提示在HCMV感染导致肝功能损伤的病理、生理过程中，可能存在基因的协同与抑制作用。

综上所述，携带有UL133基因型的HCMV感染婴幼儿后，可直接诱导Caspase-3、Caspase-6蛋白表达上调，从而导致肝功能损伤；未携带有UL133基因型的HCMV感染婴幼儿后，易处于潜伏感染状态。本课题主要从内部揭示HCMV UL133基因型诱导肝功能损伤的病理、生理机制，为HCMV基因型与机体肝功能损伤的内在相关性提供分子理论依据；关于HCMV基因多态性中的基因协同与抑制作用，将在后续课题中进一步研究。

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