重症社区获得性肺炎患者外周血单核细胞Toll样受体4的表达及临床意义

李俏俏 李隆祥 罗建华 王晨 潘君素

重症社区获得性肺炎（SCAP）病死率高，医疗费用高，是临床医生经常需要面对的棘手问题.对于SCAP在重视抗菌药物合理治疗的同时更应强调全身综合治疗，包括免疫调节治疗。Toll样受体（TLR）家族作为人体固有免疫系统中的细胞跨膜受体及模式识别受体之一，可以识别多种病原相关分子模式，继发产生大量炎症因子，从而在宿主防御中发挥重要作用。TLR家族具有多个成员，至今已发现15种TLRs，研究表明TLR4、TLR5、TLR9在革兰阴性菌引起的炎症反应中起重要作用，其中研究最为深入的是TLR4，主要表达于单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞等多种免疫细胞上，是脂多糖（LPS）的天然受体[1]。在动物实验中，研究的较清楚的是TLR4与LPS介导的信号转导途径，其在内毒素耐受产生中亦起关键作用[2]。而SCAP患者外周血单核细胞TLR4的表达和炎性因子释放及体外LPS刺激后TLR4和炎性因子的表达情况及可能的临床意义，目前报道较少。本研究旨在探讨SCAP患者外周血单核细胞TLR4的表达情况及临床意义，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2014年1月至2015年1月入住本院呼吸科（15例）及 ICU（35例）的 SCAP患者共 50例（SCAP组），其中男34例，女16例，年龄38～75岁（65±7）岁；根据肺炎严重程度评分系统[3]将SCAP组患者按照总分≤50分、51～70分、71～90分、91～130分和＞130分，分为Ⅰ级（1例）、Ⅱ级（4例）、Ⅲ级（23例）、Ⅳ级（17例）和Ⅴ级（5例），并按Ⅰ～Ⅲ级、Ⅳ级、Ⅴ级分别划为低、中、高危者。入选标准：均为社区获得性肺炎患者，未到其他医院治疗；符合美国感染性疾病学会/美国胸科学会2007年颁布的成人社区获得性肺炎管理指南中危重症的分型标准。排除标准：院内获得性重症肺炎患者，有明确肿瘤病史；长期服用激素、免疫制剂史及免疫缺陷史。选取同期本院健康体检者50例作为对照组，其中男 32 例，女 18 例，年龄 35～71（62±9）岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分析 入院48h内32例SCAP患者获取合格痰标本，另18例获取经气管插管防污染毛刷标本，对这些标本进行病原菌分析。

1.2.2 外周血单核细胞的分离和鉴定 抽取两组受试者入院第1天空腹外周静脉血20ml，肝素抗凝并分离血清后，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，将细胞悬液置于细胞培养皿内，放置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱孵育2h后，获得贴壁单核细胞，加入1640完全培养液（武汉普诺赛生命科技有限公司，PM150110，500ml），培养12d后备用。在倒置相差显微镜（日本奥林巴斯，BX53）下观察细胞形态，采用流式细胞术对CD14阳性单核细胞进行鉴定。

1.2.3 cDNA模板的合成 本实验所用的试剂盒、生物酶、基因及引物均由上海生工生物工程技术有限公司提供。采用组织和细胞总RNA提取法（TRIzol法）提取单核细胞总RNA，逆转录合成cDNA模板，反应体系包括：1μg样本 RNA，水 10μl，RT 缓冲液 5μl，10mM 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1.25μl，40U/L RNA 酶抑制剂0.5μl，经 42℃ 15min，72℃ 5min，4℃ 5min 进行反转录，合成的cDNA模板-20℃保存备用。

1.2.4 TLR4 mRNA表达量及炎症因子水平的测定 采用实时定量PCR法测定TLR4 mRNA的表达量，反应体系包括：cDNA 模板 2μl，水 1μl，1μM 的正向引物1.5μl，1μM 的反向引物 1.5μl，DNA 酶 0.5μl，PCR 反应混合液（PCR Master Mix）5μl，经预变性：95℃，30s；变性：95℃，5s；退火：60℃，30s；延伸：72℃，30s；再延伸：72℃，1min；最后延伸：55℃，30s，循环 40 次，获得 PCR产物TLR4 mRNA，以内参GAPDH基因为内标，以2-△△Ct法计算TLR4 mRNA的相对表达量。TLR4及内参引物见表1。取分离出的血清，采用ELISA法测定 TNF-α、IL-6、IL-8、C 反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）水平，具体操作步骤按试剂盒（上海恒远生物科技有限公司提供）说明书进行。在1640完全培养液中，进行重悬单核细胞，加入LPS 40g/ml，培养皿放置于 37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育24h，然后收集单核细胞继续培养24h后离心，分离血清，实时定量PCR法检测TLR4 mRNA的表达量，ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、PCT 水平。

表1 T L R 4及内参引物

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，两组比较采用t检验，相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCAP组标本分离出的病原体 见表2。

表2 S CA P组标本分离出的病原体[例（%）]

由表2可见，SCAP组病原体主要为革兰阴性菌，占84.00%，分别是铜绿假单胞菌12例（24.00%）、鲍曼不动杆菌11例（22.00%）、肺炎克雷伯菌9例（18.00%）、大肠杆菌10例（20.00%）。

2.2 两组在LPS刺激前、后外周血单核细胞TLR4 mRNA表达量及血清炎症因子水平比较 见表3。

表3 两组在L P S刺激前、后外周血单核细胞T L R 4m R N A表达量及血清炎症因子水平比较

由表3可见，LPS刺激前SCAP组外周血单核细胞TLR4 mRNA表达量显著高于对照组，血清TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、PCT水平亦高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。LPS刺激后，两组TLR4 mRNA表达量和血清 TNF-α、IL-6、IL-8、CRP 水平均较刺激前升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但PCT的表达水平差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 SCAP组PSI评分与外周血单核细胞TLR4 mRNA表达量的相关性分析 SCAP组低危28例，TLR4 mRNA表达量8.03±3.17；中危17例，TLR4 mRNA表达量10.49±4.35；高危 5例，TLR4 mRNA 表达量 12.98±2.96。由此可见SCAP组PSI评分越高，TLR4 mRNA表达量也越高，两者呈正相关性（r=0.641，P＜0.05）。详见图1。

图1 S CA P组外周血单核细胞T L R 4m R N A表达量与P S I评分的相关性散点图

3 讨论

本研究中SCAP组痰标本中分离出的病原菌主要是革兰阴性菌，占84.00%，分别是铜绿假单胞菌（24.00%）、鲍曼不动杆菌（22.00%）、肺炎克雷伯菌（18.00%）、大肠杆菌（20.00%）。LPS是革兰阴性菌细胞壁上主要的致病成分，LPS进入人体后能与单核细胞TLR4相结合，诱导宿主促炎和抗炎因子失衡性表达，进而发生多脏器功能衰竭，这也是重症肺炎死亡的原因之一[4]。TLR4作为LPS的模式识别受体，起着启动炎性反应的作用，因此TLR4过量表达与革兰阴性菌感染所致的SCAP密切相关[5]。

正常情况下，TLR4主要表达于单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞等多种免疫细胞上，以内毒素结合蛋白-CD14-TLR4三聚体的形式识别LPS，并直接启动炎症反应的相关信号通路。TLR4的信号转导通路有髓样细胞分化因子88（MyD88）依赖和MyD88非依赖两条途径。MyD88依赖性信号通路[6]，主要介导核因子-κB（NF-κB）的活化，激活的NF-κB转入细胞核内，最后导致 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎症因子和调节因子的表达与生成，引发炎症级联反应。TLR4亦可激活MyD88非依赖性信号通路[7]，即含TIR结构域诱导干扰素B-接头蛋白（IFNB-TRIF）依赖性信号通路。TLR4与TRIF相关接头分子（TRAM）连接，随即从细胞膜进入胞质与TRIF相互作用，TRIF进而与TRAF3和TRAF6联合，激活TANK结合激酶1（TBK1）与IKKe，活化干扰素调节因子3（IRF3），诱导干扰素B的转录。此外，TRAF6亦可通过受体相互作用蛋白1（RIP1）激活NF-κB和MAPK，诱导促炎性细胞因子合成和释放。但是过度的炎症反应可损伤机体正常组织细胞，引起多脏器功能不全。因此，测定TLR4 mRNA的表达量及下游炎症因子的水平,对SCAP病理机制的研究有着重要的意义。

本研究结果显示，SCAP组TLR4 mRNA的表达量及血清炎症因子水平均显著高于对照组，说明SCAP组患者体内TLR4 mRNA表达量升高，并与病情的严重程度呈正相关，这与Zhang等[8]的研究结果一致。高翔等[9]的研究表明，PCT是影响老年重症肺炎患者预后的重要指标，但在本实验中，SCAP组加入LPS刺激前后PCT的水平变化差异无统计学意义，可能提示PCT并非是TRL4介导的下游炎症因子。Dou等[6]认为，NF-κB信号转导通路是LPS所介导的信号转导通路中最重要的下游通路。TLR4主要通过活化核因子NF-κB，从而激活呼吸道上皮细胞，增加黏附分子表达，促进上皮细胞中炎性细胞浸润及产生氧自由基，导致呼吸道的慢性炎症及组织器官损害，这说明TLR4/NF-κB通路可能是触发炎症反应和器官损伤的关键靶点。本研究因条件限制，未能对NF-κB表达量进行检测分析，有待进一步探讨。

本研究表明，在LPS刺激后SCAP组和对照组TLR4 mRNA的表达量及血清炎症因子水平均增高，但SCAP组增幅仅为对照组的2%～18%，提示SCAP患者外周血单核细胞对LPS的反应受损，气道定植菌长期刺激外周血单核细胞TLR4及NF-κB信号通路处于活化状态，导致TLR4下调，降低了患者单核细胞对LPS的反应性，最终形成内毒素耐受，这与Mendes等[10]的研究结果一致。内毒素耐受是革兰阴性菌感染时机体重要的保护机制，能够明显减轻“二次打击”带来的损伤，对于提高重症肺炎患者生存率和改善预后具有积极意义。TLR4作为介导LPS信号转导的主要受体，其表达量和功能下调及TLR4信号通路中各个环节的功能缺陷，都将导致内毒素耐受产生。陈华文等[11]通过动物实验发现，LPS预处理确实具有诱导“内毒素耐受”的能力,能够减轻内毒素血症导致的肺损伤,其机制可能与抑制了炎症反应和氧自由基生成有关。另有研究表明，TLR4拮抗剂可通过降低LPS对TLR4的刺激，其机制是抑制NF-κB活化，下调促炎细胞因子的释放，从而减少肺组织损伤[12]。TANG等[13]研究发现，通过分析TLR4的表达量与老年重症肺炎患者的病死率相关。

综上所述，TLR4位于炎症信号转导的最上游环节，当革兰阴性菌感染引起SCAP时，TLR4 mRNA表达量显著增高，在启动抗感染的固有免疫中起关键作用。对TLR4的信号转导机制的进一步研究，将有助于我们更加明确疾病机制，从而为临床预防和治疗细菌感染提供新的思路和方法，TLR4拮抗剂有望成为SCAP诊治中新的分子治疗靶点。

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