浸润性肺腺癌组织上调表达基因的筛选及验证

刘超武 续力云 陈军 乐涵波

肺癌是全球癌症死亡最主要的原因，其5年生存率仅15%，我国肺癌发病率每年增长26.9%，占全部恶性肿瘤死亡的22.7%，且发病率和病死率仍在迅速上升。肺癌从组织学类型上分为小细胞肺癌（small cell lungcancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC），其中约 80%为 NSCLC，包括腺癌（adenocarcinoma，ADC）、鳞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和大细胞癌等，占比最多的是肺腺癌。本研究通过对比浸润性肺腺癌组织与癌旁组织差异表达基因，筛选及验证浸润性肺腺癌组织上调表达基因，寻找肺腺癌诊断和预后评估的新型分子标记物，为进一步探讨肺腺癌的发生、发展机制提供实验依据。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2014年1月至2015年1月本院经手术病理证实的肺腺癌患者6例，制作癌组织及相应癌旁组织基因表达谱芯片,其中男4例，女2例；年龄52～68，平均62.2岁；肿瘤最大径1.5～5cm，平均2.6cm；有吸烟史4例；淋巴结转移1例；所有患者均无胸膜侵犯。另收集2015年1月至2016年6月本院经手术病理证实的肺腺癌组织样本97例，上述6例样本亦纳入，共103例，应用实时荧光定量PCR技术（qPCR）扩增目的基因，分析癌组织目的基因的表达情况，其中男36例，女 67 例；年龄 53～69（63.0±5.7）岁；肿瘤最大径 1.5～5（2.54±1.34）cm；有吸烟史 20例；淋巴结转移 13例；胸膜侵犯19例；根据第7版肺癌TNM分期，Ⅰ期4例，Ⅱ期1例，Ⅲ期1例。纳入标准：所有病例均经术后病理确诊；术前未经放化疗治疗；无明显肝肾功能损害；术后临床病理资料完整，包括性别、年龄、吸烟史、肿块大小、病理类型、转移情况、分期；排除恶性肿瘤史及其他部位原发肿瘤转移病灶。按2011年肺腺癌新分类标准，经2位病理医生诊断均为浸润性肺腺癌。所有标本另取相应癌旁组织（切缘距肿块2cm）作对照。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片 基因芯片制备委托上海伯豪生物技术有限公司完成。运用表达谱芯片平台制作6例浸润性肺腺癌组织及相应癌旁组织基因表达谱芯片。芯片的起始样本为总RNA，采用专用于提取组织总RNA的Recover AllTMTotal Nucleic Acid Isolation（Cat#AM1975，Ambion，Austin，TX，美国）提取试剂盒，经NanoDrop ND-2000 分光光度计及 Agilent Bioanalyzer2100（Agilent technologies，Santa Clara，CA，美国）进行质检。每个样本使用100ng总RNA，由小牛肠碱性磷酸酶在37℃条件下反应30min进行去磷酸化处理，15%浓度的二甲基亚砜（DMSO）使RNA变性后，通过T4-RNA连接酶（T4 RNA Ligase）连接标记物Cyanine3-pCp，16℃条件下反应2h。标记后对样本进行干燥处理以去除残余DMSO。准备好10X阻断剂。用无核酸酶的纯水溶解干燥后的样品，依次加入阻断剂和杂交缓冲液，100℃5min后立即转入冰上放置5min。将杂交样品缓慢加入垫片的小室中，芯片反应面向下盖在垫片之上，盖上并固定，同时避免气泡产生，20r/min、55℃条件下杂交20h。杂交反应后依次用基因表达清洗缓冲液清洗芯片，在基因表达清洗缓冲液中拆除杂交装置，并将芯片放入基因表达清洗缓冲液中继续清洗。尽快扫描芯片，以减少环境氧化剂对信号强度的影响。Feature Extraction（FE）9.5.3软件提取扫描结果。

1.2.2 引物的设计与合成 所有引物序列均引用于Pubmed、Nucletide Tools，其序列均来自各基因转录本的编码序列（CDS），且所有引物设计条件均满足以下条件：引物长度17～25bp，GC含量保持在45%～55%，熔链温度（Tm）为 60℃左右，A、C、G、T碱基分布均匀。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。本实验以短小杆菌RNA结合蛋白家族成员-1（PUM1）为内参基因。引物序列如下引物（5′～3′）：PUM1，上游-GGCTTTGGCAGAACGGATTC，下游-TCTCATTCTGCTGGTCTGAAGG；SPINK1，上游-ATATGACCCTGTCTGTGGGAC，下游-CAGCAAGGCCCAGATTTTTGA；ITGA11，上游-ACCCAATCTGCACACTCCAG，下游-TGGGTTCATTCTTCGGGAGC；TOX3，上游-AGTGGCATAGGAGGGAAAAGC，下游-GACACTTGAGAGGACCGTTTGA；SPP1，上 游 -TGCTTCTTTCTCAGTTTATTGGTTG，下游-AGGGAGTTTCCATGAAGCCAC；MCM10，上游-CACCAGGTTGGTGTCTGAGC，下游-GCTCACCCTCAGCCTTTACA；MMP12，上游-AGTTACCTTCAAAGGCCAAGAGA，下游-AGTCCAAGGATGTTAGGAAGCA；FOXA1，上游-AAGTTACAAGGACCCCAACCC，下游-GAAGCAGAGTTCTTGAGGGCA；TMEM45B，上游-GGCACAGGTGTCCTGATGG，下游-GCGGGTACTTCACTGACCAA；SIX1，上-AAACCAACAGCGATCTCAAGC，下游-AACAGGCGTATCAGTTGCCC；CEACAM1， 上 游 -AGAACCAAAGCGACCCCATC，下游-TCATTGGAGTGGTCCTGCC；CYP2J2，上游-CTGCTCAGATGTGTTGGGACA，下游-ATTCGGACGAGACAGTAGAGC；GDF15， 上 游 -CTGAGACACCCGATTCCTGC， 下 游 -ACACAGTTCCATCAGACCAGC；CLIC6，上游-AGTGCTGGTGGTATCGTGTG，下游-ACTCCCTCCCTAACTGGACC；ESR1，上游-CAGCGACGACAAGTAAAGTGG，下游-TCCCAGATGCTTTGGTGTGG；COLLA1， 上 游 -GCACAGACGGAGATAAATGGC，下游-ATACCAGGCTCAACCACTGC。

1.2.3 实时荧光定量PCR 每一样本组织均设3个重复孔，反应体系：cDNA 溶液 1μl、SYBRPremix Ex TaqⅡ（2×）10μl、上游引物（10μM）0.8μl、下游引物（10μM）0.8μl、ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μl、DEPC 水 7μl，共20μl，配制过程均避光在冰上完成。应用7500荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司），扩增反应条件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。每个样本取3个重复孔Ct值平均数。

1.2.4 观察指标 以PUM1为内参基因，获得各样本组织ΔCt值（各目的基因Ct值-PUM1 Ct值），通过公式RQ=2-ΔCt计算肺腺癌组织RQC值及相应癌旁组织RQN值。然后转换为对数值log2RQ对肺腺癌组织及相应癌旁组织各目的基因表达水平进行分析。最后通过公式FC值=RQC/RQN得到肺腺癌组织相对于癌旁组织各目的基因FC值，并转换为对数值log2FC以分析各目的基因在肺腺癌中表达水平。对于FC值≥2，即log2FC≥1，认为该基因在肺腺癌组织表达上调；1/2＜FC值＜2，即-1＜log2FC＜1，认为该基因在肺腺癌组织表达无变化；FC值≤1/2，即log2FC≤-1，认为该基因在肺腺癌组织表达下调。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，肺腺癌组织与相应癌旁组织各目的基因表达水平比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因芯片初步筛选结果 通过Genespring软件系统，结合SAM软件分析方法，筛选在两种软件较高可信度范围内均为差异表达基因，结果显示，与癌旁组织相比，在浸润性肺腺癌组织，共有1621个上调表达基因（P＜0.05），进一步通过 Gene ontology 、Pathway分析、标记物预测分析和基因网络关系分析方法对芯片数据进行处理，结合The Lung Cancer数据库检索与肺癌发生相关的mRNA信息，初步筛选出在浸润性肺腺癌组织14个上调表达基因，详见图1、表1。

图1 6例浸润性肺腺癌癌组织与癌旁组织基因表达主成分分析图

由图1可见，主成分1轴（Comp.1）上，癌旁组织样本基因表达谱分布较集中（绿色点），波动较小，即组内差异较小；主成分2轴（Comp.2）上，各肺腺癌组织样本基因表达谱所代表的点和各癌旁组织样本基因表达谱所代表的点分别分布在两个不同象限，无交叉现象，主成分分析图表明基因芯片数据较可靠。

2.2 浸润性肺腺癌组织各目的基因mRNA表达水平分布图 见图2。

由图2可见，以患者编号为横坐标，以mRNA在浸润性肺腺癌组织相对癌旁组织表达水平log2FC为纵坐标，按log2FC从小到大排列获得14个目的基因mRNA在肺腺癌组织表达水平柱形分布图，结果表明，与相应癌旁组织相比，SPINK1 mRNA、TOX3 mRNA、MMP12 mRNA、CLIC6 mRNA、TMEM45B mRNA 在浸润性肺腺癌组织表达上调，差异均有统计学意义（P＜0.01），而ITGA11 mRNA、SPP1 mRNA、MCM10 mRNA、COL11A1 mRNA、SIX1mRNA、FOXA1mRNA、GDF15mRNA、CEACAM1 mRNA、ESR1 mRNA在肺腺癌组织表达未见上调，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 6例浸润性肺腺癌癌组织与癌旁组织差异表达基因列表（n=14）

图2 浸润性肺腺癌组织各目的基因m R N A表达水平分布图（横坐标为患者编号；纵坐标为m R N A在浸润性肺腺癌组织相对癌旁组织表达水平l o g 2F C）

3 讨论

目前，肺癌是人类发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其中肺腺癌是肺癌最常见的病理类型。由于肺癌的高度侵袭性及异质性，多数肺癌患者在确诊时已经发生淋巴结、血行或远处转移，是其预后较差的主要原因[11]。目前，影像学检查是术前诊断肺腺癌的主要手段，但其缺乏特异性，且受接诊医生经验等主观因素影响较大，仍存在较高的误诊及漏诊率。肿瘤分子标记物已逐渐被国内外学者们所发现，对肺腺癌诊断、治疗、预后评价等方面具有重要意义[12-14]。本研究从肿瘤分子标记物思路出发，探讨在浸润性肺腺癌组织中上调表达的mRNA分子，可能成为浸润性肺腺癌早期诊断的新方向。

本研究初期经过基因芯片方法寻找浸润性肺腺癌组织与癌旁组织差异表达基因，共有14个上调表达基因，分别为 SPINK1、ITGA11、TOX3、SPP1、MCM10、MMP12、COL11A1、SIX1、FOXA1、CLIC6、TMEM45B、GDF15、CEACAM1、ESR1，进一步扩大样本量检测浸润性肺腺癌组织及相应癌旁组织以上14个基因的表达情况，qPCR验证结果表明，与相应癌旁组织相比，SPINK1 mRNA、TOX3 mRNA、MMP-12 mRNA、CLIC6 mRNA、TMEM45B mRNA在浸润性肺腺癌组织上调表达，而ITGA11 mRNA、SPP1 mRNA、MCM10 mRNA、COL11A1 mRNA、SIX1mRNA、FOXA1mRNA、GDF15mRNA、CEACAM1 mRNA、ESR1 mRNA在肺腺癌组织表达未见上调。

SPINK1又称胰腺分泌的胰蛋白酶抑制剂或肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂（tumor-associated trypsin inhibitor，TATI）[15]，在正常情况下表达产生一种胰酶抑制剂，通过自分泌或旁分泌的方式抑制胰蛋白酶分泌，防止自身“过度消化”。现已被证实在多种癌症，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肝细胞癌中异常表达[16-18]，且其高表达与肿瘤的浸润与转移密切相关，但在肺腺癌中异常表达报道较少。Kati等[19]指出，SPINK1参与了多种生理过程，同时也作为一种急性期反应物，抑制细胞凋亡，在肿瘤的发生、发展中发挥作用，并可能成为肿瘤的治疗靶点。Lazar等[20]认为SPINK1可能可以为肺癌的早期诊断提供依据，尤其是鉴别鳞癌与腺癌。Pallante[22]也认为SPINK1通过调节细胞迁移和组织修复，间接地参与肺癌的发生、发展，其过度表达常常提示不良的预后。

TOX3是TOX家族的一员，主要在发育中的小鼠脑中表达，在胚胎E14期达到一个峰值。与乳腺癌的发生有很强的相关性，其表达水平在乳腺癌组织中增加。Mathewos等[23]认为TOX3具有灭活靶向神经元发育的功能，TOX3甲基化在肺癌患者中比较普遍，其在正常肺组织中也可表达，但在肺肿瘤患者的组织中呈现高表达，且在鳞癌患者中表达更高。Jiang等[24]也发现TOX3的存在可能增加肺癌发生的概率，并且在肺癌的发生、发展中扮演重要角色。

MMP-12表达产生的基质金属蛋白酶是一类具有降解细胞外基质的蛋白酶，通过降解细胞外胶原蛋白及基底膜成分使恶性肿瘤细胞向相邻周围组织浸润、迁移及转移。Wang等[25]通过研究软骨肉瘤的侵袭信号通路发现MMP-12与SCLC患者的局部复发和转移相关。目前，MMP-12 mRNA已被证实在肺癌、肝癌、大肠癌、外阴癌和胰腺癌等诸多癌症癌组织中有表达[26]。Hofmann等[26]报道MMP-12 mRNA的表达能较好地预测SCLC早期复发和转移的风险。Lv等[27]通过体外细胞培养研究也证实，MMP-12的高表达与肺腺癌患者的病理分期和肿瘤转移相关，敲除MMP-12基因可抑制肺腺癌细胞的生长和浸润，表明MMP-12可能是治疗肺腺癌的治疗靶点。Tian等[28]应用qRT-PCR的方法检测NSCLC患者癌组织及癌旁组织差异表达的基因，结果表明MMP-12可能可以参与SCLC的发生、发展，并且可以用作SCLC的潜在标记物或治疗靶标。然而，MMP-12 mRNA表达在浸润性肺腺癌癌组织与癌旁组织是否存在差异鲜有报道。本研究通过荧光定量PCR的方法检测浸润性肺腺癌组织及相应癌旁组织MMP-12 mRNA表达，结果显示MMP-12 mRNA水平在浸润性肺腺癌组织上调表达，提示可作为肺腺癌诊断和预后评估的新型分子标记物。

细胞内氯离子通道家族（CLIC）在人类中由6个保守蛋白组成，这些保守蛋白是一组神经蛋白，采用可溶性的方式与膜结合[29]。细胞内氯离子通道-6（CLIC-6）是家族中的一员，Achim Bell等[30]发现CLIC-6的下调与腺样囊性癌的发生、发展有一定的相关性。Yan等[31]研究了CLIC6在人类甲状腺中的表达，结果表明，CLIC6可能在甲状腺功能中发挥作用，其可能与家族性甲状腺肿的遗传异质性有关。目前很少有文献报道CLIC6在肺腺癌中的表达和作用，表明CLIC6可能成为诊断肺腺癌的一个新的方向。

TMEM45B，即跨膜蛋白45B，已在多种人类癌症中观察到TMEM表达的改变，但是很少有报道TMEM45B在肺癌中的表达和作用。Hu等[32]使用癌症基因组图谱重新分析和评估TMEM45B在肺癌组织中的mRNA表达水平。结果显示，TMEM45B在肺癌中过度表达，且其表达与患者的总生存相关，提示TMEM45B是肺癌中潜在的预后标记物和治疗靶标。Zhao等[33]也提出TMEM45B在SCLC的发生、发展中扮演了重要的角色，提示其可能成为肺癌的新型标记物。Molina-Pinelo等[34]进一步研究了肺腺癌患者和肺鳞癌患者组织中TMEM45B的表达差异，结果显示TMEM45B在肺鳞癌患者癌组织中的表达明显少于肺腺癌患者，提示TMEM45B可能与不同肺癌病理之间的相关性。

综上所述，与相应癌旁组织相比，SPINK1 mRNA、TOX3 mRNA、MMP-12 mRNA、CLIC6 mRNA、TMEM45B mRNA在浸润性肺腺癌组织上调表达，提示可能对浸润性肺腺癌诊断及治疗具有重要意义，但以上基因在浸润性肺腺癌发生、发展过程中的作用机制，仍需进一步研究。由于本研究病例数少，仍需更多样本量对其进行验证。

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