炮制对地榆中鞣质类成分含量及凝血作用的影响

赵慧 张学顺 戴衍朋 张伟 王雪 孙立立

摘要：为考察炮制对地榆中鞣质类成分以及凝血作用的影响，采用紫外可见分光光度法测定地榆中鞣质含量，采用UPLC法测定地榆中没食子酸、鞣花酸含量。结果表明，随着炮制程度的加重，总鞣质含量呈下降趋势，没食子酸先升高后降低，而鞣花酸呈上升趋势;体外抗凝血试验表明，凝血作用以炮制适中的地榆炭为最佳。

关键词：地榆;炮制;鞣质;没食子酸;鞣花酸;凝血作用

中图分类号：S567.23+9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）12-0127-05

中药地榆始载于《神农本草经》，列为中品，是蔷薇科地榆属植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）或长叶地榆[Sanguisorba officinalis L. var. longifolia （Bert.） Yü et Li]的干燥根[1]。地榆生品以凉血解毒为主，用于血痢经久不愈、烫伤、皮肤溃烂、湿疹、痈肿疮毒等;炒炭炮制后，以收敛止血力胜，用于便血、痔疮出血、崩漏下血等，各种出血证均可选用[2]。

地榆主要化学成分为鞣质和三萜类化合物，此外还有黄酮类、蒽醌类化合物[3，4]。一般认为鞣质是地榆止血作用的主要活性成分[5-7]，但炮制后鞣质成分含量变化以及止血作用报道不一[8-12]，本研究对生地榆以及不同炮制程度地榆炭的总鞣质、没食子酸、鞣花酸含量进行测定，结合凝血作用的药效试验分析了炮制程度对地榆鞣质含量和止血作用的影响，为地榆炒炭止血的炮制原理解析提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验仪器 Waters H-Class UPLC全自动高效液相色谱仪（含PDA检测器）;XS205D（1/100 000）电子天平（梅特勒托利多）;UV-2550紫外-可见分光光度仪（岛津）;HZS-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）;LC-350A型超声波中药处理机（济宁市鲁超超声设备有限公司）;数字恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）;Multiskan FC酶标仪（赛默飞世尔）。

1.1.2 试药与试剂

没食子酸对照品（批号：110831-201302）购自中国药品生物制品检定所;鞣花酸对照品（批号：10149850），购于美国阿法埃莎（Alfa Aesar）。

乙腈（色谱纯），购于美国默克;磷酸（色谱纯），购于天津科密欧化学试剂有限公司;色谱用水为蒸馏水（屈臣氏）;甲醇、95%乙醇、钼酸钠、硫酸锂、溴、盐酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙均为分析纯。

地榆饮片产地甘肃，经山东中医药大学药学院中药资源研究室林慧彬研究员鉴定，为蔷薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）的干燥根。

1.2 试验方法

1.2.1 不同炮制程度地榆样品的制备

取净地榆片300 g置预热的炒锅内，炒制不同时间，制备不同炮制程度地榆炭（表1）。

1.2.2 地榆及地榆炭中总鞣质测定 （1）对照品溶液的制备：精密称取没食子酸对照品50.0 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含没食子酸0.05 mg）。

（2）標准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水12.0、11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0 mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以相应的试剂为空白，采用紫外可见分光光度法，在760 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=118.54x+0.0298，r=0.998。说明没食子酸在0～0.0101 mg/mL线性关系良好。

（3）供试品溶液的制备：称取样品粉末（过四号筛）0.4 g，置250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，放置过夜，超声处理10 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置使固体物沉淀，过滤，弃去初滤液50 mL，精密量取续滤液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。

（4）鞣质含量测定：先精密量取供试品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照“标准曲线的制备”项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1 mL”起，加水10 mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读取供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得总酚量。

再精密量取供试品溶液25 mL，加至盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1 h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1 mL”起，加水10 mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读取供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得未被吸附的多酚量。

鞣质含量=总酚量-未被吸附的多酚量

1.2.3 地榆及地榆炭中游离没食子酸和鞣花酸的测定 （1）色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）;流动相：A乙腈，B为0.1%磷酸溶液（0～0.7 min，A 1.5%→4.0%;0.7～1.7 min，A 4.0%→30.0%;1.7～3.5 min，A 30.0%→40.0%;3.5～5.0 min，A 40%→50%）。流速0.6 mL/min;柱温35℃。波长270/252 nm。进样量0.5 μL。在上述色谱条件下，没食子酸、鞣花酸对照品和供试品的色谱图。

（2）溶液制备：分别精密称取没食子酸、鞣花酸对照品适量，加甲醇溶解，制成每毫升含没食子酸0.10 mg、鞣花酸0.45 mg的溶液，即得对照品溶液。

精密称取地榆粉末（过四号筛）0.2 g，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声处理40 min，放凉，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

（3）线性关系考察：分别吸取不同体积的没食子酸对照品溶液，注入高效液相色谱中，测定，以对照品进样质量（μg）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制出校正曲线，Y=5078154X-2979.6，R2=0.9999，表明没食子酸进样量在0.0198～0.2376 μg范围内具有良好的线性关系。

分别吸取不同体积鞣花酸对照品溶液，注入高效液相色谱中，测定，以对照品进样质量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制出校正曲线，Y=9175392X+9142.6，R2 = 0.9997，表明鞣花酸进样量在0.0123～0.1848 μg范围内具有良好的线性关系。

（4）精密度试验：按本试验色谱条件，将没食子酸和鞣花酸对照品溶液重复进样6次，每次0.5 μL，测定没食子酸的峰面积RSD为0.77%，鞣花酸的峰面积RSD为0.39%，表明精密度良好。

（5）稳定性试验：按本试验色谱条件，取供试品溶液，室温条件下，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样并进行分析，测定峰面积。结果没食子酸在24 h内峰面积RSD为0.92%，鞣花酸为0.84%，表明该供试品溶液至少在24 h内稳定。

（6）重复性试验：精密称取同一批次的地榆样品粉末6份，制备供试品溶液，精密吸取一定量的供试品溶液注入液相色谱仪，

按本试验色谱条件测定，计算没食子酸和鞣花酸含量。结果没食子酸和鞣花酸的含量分别为0.66%和0.89%，RSD分别为2.22%和2.17%，表明方法重复性良好。

（7）加样回收率：精密称取已知含量的地榆样品6份，分别加入没食子酸和鞣花酸对照品溶液适量，制备供试品溶液，按本试验色谱条件测定峰面积，计算没食子酸和鞣花酸的平均加样回收率，结果见表2。

（8）样品测定：称取地榆样品粉末，制备供试品溶液，按本试验色谱条件，测定峰面积并计算各样品中游离没食子酸和鞣花酸的含量，见表3。

1.2.4 地榆及地榆炭凝血作用测定

采集正常人抗凝血浆，加入不同炮制程度地榆提取液和钙离子，在钙离子的作用下血液开始凝固，按照预定时间用去离子水流注，收集流注液，用紫外分光光度计测流注液中游离血红蛋白的吸光度值（OD），描绘凝血时间值曲线图，观察值随时间的变化情况，以判定被测样品对凝血因子的激活程度。

通过预试验发现，地榆提取液与抗凝血接触后10 min开始出现凝血现象直至15 min，因此本试验取10 min和15 min两个时间点进行测定。

（1）抗凝血的采集：静息状态下抽取健康志愿者肘静脉血液，弃去针管前部0.5 mL血液，防止针头被组织污染，其余血液与38 g/L枸橼酸钠按1∶9体积比混匀。

（2）体外凝血试验：用1 000 μL移液器吸取各炮制程度地榆提取液

250 μL于烧杯中，空白组加入250 μL蒸馏水;吸取80 μL抗凝血浆、

25 μL氯化钙溶液于各组烧杯中，混匀，启动计时器，10 min和15 min时分别用 10 mL蒸馏水沿烧杯壁缓缓流注液体表面，轻轻摇晃后静置

10 min。

吸取流注液于比色皿中，用酶标仪在540 nm处测定每份流注液中血红蛋白的吸光度。

2 结果与分析

2.1 鞣质类成分测定结果

由表3可知，总鞣质、没食子酸、鞣花酸成分变化趋势不同：生地榆中鞣质含量达14.7%，炮制后鞣质含量呈显著下降趋势;生地榆中没食子酸含量为2.38%，炮制后含量随制炭程度加重先增加后降低，炮制适中时较高;而生地榆中鞣花酸含量最低，为3.71%，其含量随炮制程度的加重而增加，在过重的地榆炭中，其含量增加至7%左右。

2.2 体外凝血试验结果

表4表明不同的炮制程度对地榆凝血活性具有较大影响。各组在5 min内血紅蛋白的吸光度都明显降低，表明出现了加速凝血的作用。地榆炭3和4样品（炮制程度适中）在5 min内血红蛋白的吸光度变化率最高，表现出较强的促凝血作用;而地榆炭5和6样品（炮制程度重）在5 min内血红蛋白的吸光度变化率较低，表明其凝血作用较弱。生品和炮制程度较轻的样品，也具有一定促凝血作用，但弱于炮制程度适中的地榆炭。

3 讨论与结论

明朝陈家谟于《本草蒙荃》中说“凡药制造，贵在适中，不及则功效难求，太过则气味反失”。凝血试验结果表明炮制适中的地榆具有较强的凝血活性，因此适当的炮制程度确是中药发挥作用的重要因素。

一般认为地榆鞣质是其止血作用的主要活性成分[5]，通过对不同炮制程度地榆炭中鞣质含量测定以及凝血活性的研究发现，总鞣质与凝血作用无正相关关系;前期试验结果以及文献报道也显示大分子的单宁酸止血作用较差，而没食子酸和鞣花酸具有较好的止血活性[6，7]，因此曾推测小分子的鞣质类成分可能与地榆止血功效有较大相关性。本试验结果显示，没食子酸与凝血活性变化的趋势相似，没食子酸可能是其促凝止血的主要活性成分之一;而鞣花酸与之差别较大，其原因可能与鞣花酸的水溶性较差有关。

参 考 文 献：

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