大葱离体雌核发育诱导单倍体研究

陈伟 孙杨 王清华 王海英 高莉敏

摘要：以大葱未开放花蕾为试材，研究花蕾大小、培养基、外源激素浓度配比不同对大葱离体雌核诱导单倍体的影响，旨在建立大葱离体雌核发育诱导单倍体技术体系。结果表明：直径为2.0～2.5 mm的未开放花蕾为最适外植体;在MS培养基中添加1.0 mg·L-1 2，4-D和1.5 mg·L-1 6-BA时，其雌核发育胚诱导率可达3.5%;在B5培养基中添加1.0 mg·L-1 2，4-D和1.0 mg·L-1 6-BA时，其雌核发育胚诱导率可达2.5%。将雌核发育胚转移至不含外源激素的1/2MS培养基中诱导生根，可发育成完整植株。通过根尖染色体计数分析，136株再生植株中有15株为单倍体，单倍率11%。由单倍体加倍获得的双单倍体是重要性状遗传分析、分子标记及数量性状研究的理想材料，此研究可为大葱遗传育种奠定基础。

关键词：大葱;雌核发育;诱导;单倍体

中图分类号：S633.103.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）12-0010-06

大葱（Allium fistulosum L.）是典型的异花授粉作物，育成优良自交系至少需要6～10年的时间。而通过单倍体途径在较短时间内就可以选育出整齐一致的纯系，同时由于不存在等位基因位点的显隐性作用，一些由隐性基因决定的性状便可以得到充分表现，这样在筛选育种材料时能大大降低误选频率，明显提高选择效果。此外，单倍体培养可以快速获得双单倍体群体。利用突变技术来创造有用变异已被实践证明是一种非常有潜力的育种方法，而在离体培养中，双单倍体技术则是促进突变技术应用的更有效的方法，至今全世界已在150多种植物中选出近2 000个优良突变品种在生产中推广应用[1]。

关于未受精子房和胚珠離体培养的研究，最早的工作始于20世纪50年代，但直到70年代末才出现了研究成功的报道。San Noeum[2]利用大麦未受精子房在离体条件下培养获得了单倍体再生植株，并首次釆用了“雌核发育”（gynogenesis）一词来说明在离体条件下由未受精胚囊产生单倍体植株的现象。从此，国内外许多学者开始对各种植物的离体雌核发育展开研究。颜昌敬与赵庆华[3]在进行水稻叶鞘与枝梗愈伤组织诱导再生植株的研究时，也由子房培养获得了小植株。借助单倍体技术我国已成功育成水稻品种近百个，小麦品种十多个，玉米、大白菜、油菜品种多个，以及甜椒、烟草和果树等新品种，总计种植面积超过200万公顷，是世界上借助单倍体技术育成品种最多、应用最广的国家[4]。

目前，关于大葱离体雌核诱导单倍体研究还未见报道。本课题主要研究在大葱雌核离体培养过程中，花蕾大小、培养基类型、外源激素添加对雌核发育和胚状体诱导的影响。本研究结果可为大葱雌核发育诱导单倍体再生体系的建立提供理论依据，并为大葱杂交种选育、分子标记研究、遗传图谱构建等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料的获取

大葱品种鲁葱杂5号，由本课题组选育。2015年7月5日播种于山东省农业科学院蔬菜花卉研究所试验基地，同年10月8日将葱苗定植于温室大棚中，次年3月中旬抽薹后取材。分别选取直径2.0～2.5、2.5～3.5 mm两种大小的未开放花蕾作为试材。

1.2 试验材料的处理和培养

选材后剪去花柄，在超净工作台上用75%的酒精溶液表面消毒30 s，再用有效浓度5%（体积比）的NaClO消毒15 min，然后用无菌水冲洗3遍，最后用灭菌滤纸吸干表面水分，分别接种在不同外源激素浓度配比的B5和MS培养基中（表2和表3）。

培养条件：温度（24 ± 2）℃，光照强度25 μmol·m-2·s-1，光周期15 h·d-1。

所有诱导培养基均添加100 g·L-1蔗糖和7 g·L-1植物凝胶，然后将其pH值调至5.8，并于高压灭菌锅中121℃灭菌20 min。用直径90 mm的培养皿分装培养基，Parafilm石蜡膜封口，每处理接种20个培养皿，每皿接种花蕾20个，即每个处理接种400个花蕾。

1.3 植株再生

花蕾在单倍体诱导培养基中诱导成为胚状体，待芽生长至大约1 cm后转入无植物生长调节剂、含有30 g·L-1蔗糖的1/2MS培养基中发育成完整植株。植株生长至两叶一心后，打开瓶盖驯化培养3～5 d，用镊子小心地将幼苗取出用自来水冲洗干净，移栽到装有高温灭菌蛭石的营养钵中，在培养室培养成活后定植于温室中。

胚状体诱导率（%）= 有胚状体发生的外植体数/接种外植体总数×100。

1.4 倍性鉴定

染色体计数法：每株取2～3 mm长的新生幼嫩根尖进行染色体鉴定，经卡诺氏液固定过夜后，使用70%的酒精在4℃冰箱中保存备用。切取的根尖部分用1%的醋酸洋红染色，覆上盖玻片，用镊子一端垂直轻轻敲片，使染色体散开。在显微镜下观察，选取染色体分散较好的体细胞拍照，统计染色体数。

2 结果与分析

2.1 花蕾在诱导培养基中的发育过程

接种在添加不同浓度外源激素的培养基中的花蕾2 d后陆续开放，伸出花丝，5 ～ 6 d 后花药败育，15 d左右子房开始逐渐膨大，珠被表面开始发白发亮。大约50 d后，从子房中长出雌核发育的胚，之后胚逐渐增多，直到5个月后很少再出现成胚。

2.2 花蕾大小对离体雌核诱导单倍体的影响

分别将直径为2.0～2.5 mm和2.5～3.5 mm的未开放花蕾接种在培养皿中，每皿接种20个，5个月后统计出胚率。由表1可以看出，在培养基B5和MS中，直径为2.0～2.5 mm的未开放花蕾诱导出的胚状体个数明显高于直径为2.5～3.5 mm的未开放花蕾胚状体诱导数。所以，进行大葱离体雌核诱导单倍体时，要注重对花蕾大小的选择，这样可提高再生植株的诱导频率。

2.3 不同培养基及外源激素浓度对离体雌核诱导单倍体的影响

以B5和MS为基本培养基，分别添加不同浓度的外源激素，进行大葱离体雌核单倍体诱导。由表2可以看出，在添加了1.0 mg·L-12，4-D和1.0 mg·L-1 6-BA的B5培养基中，其雌核发育胚总诱导率可达2.5%。由表3可以看出，在MS培养基中添加1.0 mg·L-12，4-D和1.5 mg·L-1 6-BA时，其雌核发育胚总诱导率最高，可达3.5%。表明这两种培养基比较适合大葱离体雌核发育诱导成胚，其中MS培养基更适合大葱离体雌核诱导单倍体。

2.4 植株再生及倍性鉴定

将胚状体转移到未添加外源激素的含有30 g·L-1蔗糖的B5培养基中，发育成136棵完整植株。个别植株存在分蘖现象，也就是说可以由一株变为两株甚至更多株，所以本试验中胚状体诱导数目和成苗数不统一，有增加现象的就属于这种情况，另有些减少情况的基本是胚状体没有成苗。

以正常二倍体大葱为对照，对试验所得再生植株根尖细胞染色体数进行统计分析，发现部分植株的根尖染色体细胞含有8条染色体，诱导再生的136棵植株中有15株为单倍体，单倍体率达11%。

3 讨论与结论

在利用未授粉子房、胚珠离体培养单倍体方面，已在黄瓜[5]、甜瓜[6，7]、西葫芦[8，9]等许多蔬菜作物上成功报道;在葱属植物研究中也取得了一定的成果，如田慧桥等[10]研究了韭菜未传粉子房的培养及单倍体胚胎发生和植株再生;刘颖颖等[11]对大蒜进行了未受精子房离体培养，获得了单倍体植株;刘冰江等[12]进行了洋蔥离体雌核发育诱导单倍体研究，并获得了洋葱单倍体植株。本研究以大葱未开放花蕾为外植体成功获得了单倍体植株。

在利用离体雌核诱导单倍体过程中，外植体发育程度是一个重要的影响因素，对于子房接种适宜时间节点的界定，不同作物的结论相差很大。大麦胚珠离体培养时，在胚囊快成熟的时期容易诱导出单倍体植株，但诱导率最高出现在单核至四核胚囊时期[2]。洋葱从大孢子母细胞至成熟胚囊期的整个过程中都能诱导单倍体植株[13，14]。目前尚未见大葱花蕾直径大小与胚囊发育时期关系的相关报道，而且大葱品种不同、花蕾属于成株开花还是半成株开花，其花蕾直径大小与胚囊发育时期的关系应该也不相同。本试验针对鲁葱杂5号品种半成株开花时期的花蕾大小进行研究，当花蕾直径为2.0～2.5 mm时诱导单倍体成功率较高。

大葱离体雌核诱导单倍体成功与否，培养基和外源激素起着至关重要的作用。大多未受精子房或胚珠培养通常采用Miller、N6、MS、H、White或其改良型培养基加上适宜浓度的外源激素进行培养[15]。刘颖颖等[11]筛选出的适宜大蒜未受精子房离体培养的诱导培养基为：B5+2 mg· L-1 6-BA+1 mg· L-1NAA;关于洋葱离体雌核发育诱导单倍体的研究较多，筛选到的培养基各不相同，刘冰江等[12]筛选出的适宜培养基为含有1.5 mg· L-1 2，4-D+1.5 mg· L-1 6-BA或2.0 mg· L-1 2，4-D+2.0 mg· L-1 6-BA的B5培养基，Yarali等[16]筛选出的适宜培养基为BDS+2 mg· L-1 2，4-D+1 mg· L-1 6-BA，Michalik等[17]筛选出的适宜培养基为B5或BDS+2.0 mg·L-1 2，4-D+2.0 mg·L-1 6-BA。本试验采用B5和MS为基本培养基，添加不同浓度的2，4-D和6-BA进行培养，筛选出的适宜培养基为MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+1.5 mg·L-1 6-BA以及B5+1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 6-BA，这两种培养基都能有效地刺激大葱离体雌核的发育。

单倍体只有加倍成为双单倍体才能应用于育种实践。本试验通过对再生植株进行倍性鉴定，发现其中既有单倍体也有二倍体。之前类似的研究中也发现，诱导单倍体所获得的再生植株经检测，大多是单倍体、二倍体甚至多倍体都存在。通过西葫芦未受精子房离体培养获得的再生植株，其中二倍体植株占60%[18];而利用黄瓜胚珠进行离体培养，再生植株的单倍体率仅为18.2%[19]。可见，植物单倍体培养中广泛存在着染色体自然加倍现象，但其原因和加倍的具体时期尚不明确。有的材料自然加倍率可达10%，而有的材料几乎不发生自然加倍[20]，这些都说明非单倍体率在不同作物间存在显著差异。Keller和Armstrong曾提出小孢子胚自然加倍与胚胎发生初始的核内有丝分裂相关[21]，而小麦的游离小孢子培养研究则证明再生植株的自然加倍率与外植体的预处理方式也有密切关系[22]。本研究中大葱离体雌核诱导培养的单倍体率较低，仅为11%，其余的二倍体属于自然加倍形成的双单倍体还是体细胞形成的普通二倍体植株，尚无有效的鉴定方法。在下一步研究工作中，将结合胚珠发育的全过程细胞组织学研究和再生植株自交后代性状观察，深入分析再生植株来源和染色体自然加倍现象。

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