干细胞来源的细胞外囊泡影响肝再生的研究进展

广东医科大学附属医院肝胆外科，广东 湛江 524001

【Abstract】 Serious liver damage may ultimately cause liver failure. Much attention has been paid to understanding of molecular mechanisms underlying liver damage and liver regeneration. Extracellular vesicles (EVs) secreted by various types of cells were known as the carriers of information communication and can modulate target cells’ biological behaviours through contents-proteins, mRNA and miRNA. EVs deprived from stem cells can regulate the proliferation and apoptosis of hepatocytes and hepatic stellate cells (HSCs), which is great significance to liver regeneration. This article reviewed the functions of EVs deprived from stem cells to deepen our understanding of the mechanism of those EVs.

【Keywords】 Liver regeneration; Extracellular vesicles; Exosomes; Microvesicles; Stem cells

肝脏不仅是人体营养物质代谢最重要的器官，也是有机体执行生物转化功能最大的场所。体内外的众多因素，包括基因性、代谢性、药物性和病毒性等均可导致肝损伤[1-2]。一方面，急性、严重的肝损伤或慢性肝损伤的急性加重可导致肝功能衰竭、肝性脑病等，甚至短期内死亡；另一方面，慢性持续性的肝损伤可导致肝纤维化，并发门静脉高压、上消化道大出血等，慢性乙型/丙型病毒性肝炎肝硬化和酒精性肝硬化等还可以进一步发展为原发性肝癌，严重影响患者生命[3-4]。尽管肝细胞具有强大的再生能力，但在急性、严重的肝损伤时，肝细胞的再生修复能力仍不能完全维持肝功能正常[5-6]。而临床上肝损伤最有效的治疗方案仍是肝移植。限于供体肝脏来源有限及术后长期的抗排斥治疗，能够接受肝移植手术的患者非常少。因此，肝损伤及其修复一直是肝脏疾病研究的前沿热点问题。

事实上，肝损伤的修复是一个极为复杂的病理生理过程，其中涉及许多细胞与分子事件，肝脏损伤后肝脏精细结构与功能重建需要肝内外各类型细胞之间相互协调和严格调控，尤其是肝内微环境稳态的重建与维持对肝功能恢复至关重要。最近研究[7]表明：肝内外各种细胞产生的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)在细胞间通信及肝内微环境稳态中发挥着重要作用。EVs是一类富含各种蛋白质、脂类物质及核酸成分如DNA、RNA和microRNA等的微小囊泡[8-9]，作为细胞间的信息交流载体，肝内外许多具有干细胞特性的细胞，包括肝外干祖细胞、肝脏干细胞及特殊的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)所产生的EVs通过一定的途径进入肝脏后可调节肝内多种细胞包括肝细胞、HSCs、内皮细胞的活化、增殖、凋亡、自噬及迁移等，从而影响肝再生。现就该类EVs对肝再生的调控作一概述，以便更好地了解肝损伤修复的机制及探索促进肝再生的治疗方案。

1 EVs的分类及特征

EVs是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜状结构的囊泡小体，直径为40～1 000 nm。根据其形成过程及生物学特性EVs分为三类：外泌体(exosomes)、细胞膜微粒/细胞微泡(microvesicles)及凋亡小体(apoptosis bodys)[10]。凋亡小体是指细胞凋亡过程中细胞萎缩、碎裂所形成的具有质膜包裹的含核及细胞质碎片的小体，不在本文讨论范畴。

1.1外泌体外泌体是由细胞内溶酶体颗粒内陷形成的多泡体，通过与质膜融合向胞外分泌的微小囊泡，其大小较均一，直径为40～100 nm[11]。外泌体囊泡膜具有脂质双分子层结构，膜表面标记物主要有CD9和CD63，囊泡内富含多种蛋白质和核酸如mRNA、miRNA等，其中Alix和TSG101蛋白为其囊内标记物[12-14]。

1.2细胞膜微粒/细胞微泡膜微粒是由细胞通过出芽方式与细胞膜融合，直接从细胞脱落所形成的微小囊泡。膜微粒直径较外泌体大，为50～1 000 nm[8]。膜微粒内除了富含蛋白质、mRNA及miRNA外，还有大量的细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶和磷脂酰丝氨酸等，其标记物主要有整合素、基质金属蛋白酶和组织因子等[15]。

1.3EVs的作用途径EVs内含丰富的蛋白质如细胞因子、趋化因子和核酸如mRNA、miRNA等，这些蛋白质和核酸通过一定途径进入靶细胞后，可参与调控靶细胞的多种生命活动，影响靶细胞的增殖、凋亡、迁移及自噬等，是细胞间信息传递的重要载体。EVs作用于靶细胞的途径主要有：(1)直接与靶细胞胞膜融合；(2)靶细胞通过内吞作用摄取；(3)特异性受体介导[9，16-17]。

2 肝再生中具有干细胞特性的细胞来源的EVs的作用

近年来，干细胞治疗在组织损伤修复中展现出巨大的潜力。研究[18-19]表明，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有向肝细胞分化、抑制肝脏炎症反应、促进肝细胞再生和分泌多种对肝脏具有保护作用的细胞因子等的作用。但干细胞移植所带来的细胞排斥反应、医源性肿瘤形成和输入性有害物质等问题仍没得到有效解决。而MSCs来源的EVs相对于干细胞治疗则简单很多。越来越多的研究[20-22]表明,不同组织来源的成体干细胞产生的EVs不仅能诱导干细胞沿着EVs来源的细胞系方向分化，还能诱导该组织的内在修复能力。对于肝脏，干细胞来源的EVs在具有上述干细胞促进肝再生作用同时，并没有带来免疫排斥反应和新生肿瘤的问题，在促进肝再生应用方面具有更大可能和潜力。

在肝脏遭受损伤时，肝内外的许多具有干细胞特性的细胞如肝外干祖细胞、肝脏干细胞和特殊HSCs等可释放EVs包括外泌体和膜微粒，这些EVs经过上述途径进入肝脏后可发挥调节肝内细胞主要是肝细胞、HSCs和内皮细胞的增殖、凋亡和迁移等生命活动，影响损伤肝脏的再生修复。

2.1肝外干祖细胞来源的EVs对肝再生的影响越来越多的研究[5,23-24]表明，MSCs来源的EVs具有抗炎、抗凋亡和促进肝细胞再生的作用，可有效减轻肝损伤的炎症反应，改善肝细胞功能。在体外培养条件APAP/H2O2诱导的肝损伤模型中，TAN等研究表明，来源于MSCs的外泌体可通过上调肝细胞内BCL-XL和下调Caspase-3/7的表达，抑制损伤肝细胞凋亡；他们还发现，在CCl4诱导的肝损伤模型中，该外泌体同样具有改善肝细胞活力、促进肝细胞增殖和抑制凋亡的作用，进一步的检测发现，这可能和肝组织细胞内增殖相关蛋白PCNA和Cyclin D1的表达上调有关；而在缺血/再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，I/R injury)模型中。NONG等[23]还发现，MSCs来源的外泌体具有调控炎症相关因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-6及高迁移率蛋白HMGB1的表达，抑制损伤肝脏的炎症应激反应和肝细胞凋亡，降低转氨酶的释放，改善缺血再灌注损伤肝脏预后的作用。在爆发性肝衰竭动物模型中，CHEN等[24]研究发现，人经血来源的间充质干细胞(MenSCs)外泌体除了可以抑制Caspase-3诱导的肝细胞凋亡外，还可以减少肝组织内单核细胞的浸润和肝内炎症的扩散，可有效改善肝功能，提高爆发性肝衰竭生存率；进一步研究发现，这些外泌体内含有多种细胞因子如细胞黏附分子ICAM1、血管紧张素2、IGFBP6、IL-6和IL-8等，这些细胞因子通过内化进入肝细胞后可有效改善肝细胞功能和减轻肝脏的炎症反应。

HSCs作为人体肝脏主要构成细胞之一，它的持续活化一直被认为是肝纤维化发生和进展的关键环节[25]。在肝脏遭受持续性损伤时，肝细胞、Kupffer细胞和HSCs自身可合成分泌大量的TGF-β1，其可通过TGF-β受体介导活化HSCs，活化的HSCs快速分裂增殖并产生大量胶原纤维，最终导致肝纤维化、肝硬化的发生[3，26-27]。研究表明，人脐带间充质干细胞(HucMSCs)来源的外泌体除了具有上述改善肝细胞功能的作用外，还可有效抑制肝纤维化的发生发展。在肝纤维化模型中，LI等[28]发现，HucMSCs所产生的外泌体可抑制TGF-β1/Smad信号通路介导的HSCs的活化，从而减少损伤肝脏HSCs的分裂增殖，减少胶原蛋白的生成，减缓肝纤维化的进程；另外，HYUN等[29]还发现，该外泌体还可通过传递miR-125b抑制Hedgehog信号通路，抑制肝纤维化。而经miR-122修饰的脂肪MSCs来源的外泌体，进入到HSCs后，可调节星状细胞内miR-122相关靶基因如胰岛素样生长因子受体(IGF1R)、Cyclin G1和羟化酶α1的表达，抑制HSCs的活化和胶原蛋白的沉积，具有抑制肝纤维化的作用[30]。

综上所述，肝外干祖细胞来源的EVs不仅能有效抑制损伤肝组织内炎症的扩散，还能通过促进肝细胞增殖，抑制凋亡，从而加快肝细胞再生。

2.2肝脏干细胞来源的EVs对肝再生的影响研究[31]表明，成体肝脏内也存在一类具有干细胞活性的细胞，被称为肝脏干细胞。人肝脏干细胞(human liver stem cells，HLSCs)是一群寄存于成人肝脏的多潜能干细胞群，体内移植HLSCs有助于急性肝损伤小鼠的肝脏再生。HLSCs分泌的膜微粒大小类似于骨髓MSCs来源的微粒大小，并能表达多种黏附分子，通过这些黏附分子内化进入靶细胞。研究[32]发现，肝脏干细胞分泌的微粒在体外能依赖微粒表面的α4-整合素内化进入肝细胞，诱导大鼠肝细胞增殖与凋亡抵制效应。若阻断α4-整合素可明显阻止微粒渗入肝细胞。通过基因芯片与RT-PCR进一步证明分泌的微粒能运送与转录、翻译、增殖、凋亡等相关的一组mRNA。大鼠静脉注射30 μg肝脏干细胞分泌的微粒，可促进70%肝切除大鼠肝脏形态与功能的恢复，该效应与促进肝细胞增殖密切相关。若应用RNA酶预处理这些微粒，肝细胞生长增殖与肝功能恢复立刻受阻，这些结果提示，肝脏干细胞来源的微粒在肝切除后可通过水平转移特定的mRNA至靶细胞，激活并重启存留肝细胞的增殖程序。COLLINO等[33]的研究还发现，成体肝脏干细胞来源的膜微粒含有核糖核蛋白，这种蛋白质内化进入肝细胞后可参与miRNA的分选活动，影响肝细胞内核酸的转录、翻译，影响肝细胞的分裂增殖。

目前对肝脏干细胞来源的EVs的研究主要集中在对肝细胞的影响上，肝脏干细胞来源的外泌体和膜微粒对肝内炎症的发展和对HSCs的活化、增殖的影响尚需进一步探索。

2.3肝内特殊类型HSCs来源的EVs对肝再生的影响HSCs是人体肝脏的主要构成细胞之一，其位于肝脏的disse间隙内，与肝窦内皮细胞和肝细胞紧密联系，相互作用。在正常状态下，HSCs处于静止状态，合成机体所需的维生素A；当肝脏遭受病毒感染或遭受药物损伤时，HSCs可被肝细胞、Kupffer细胞和自身所产生的TGF-β1等活化并转化成肌成纤维细胞并合成大量的胶原纤维，参与肝纤维化的发生、发展。不同状态的HSCs均可产生EVs，作为细胞间信息交流的载体，不同状态的HSCs外囊泡对肝再生具有不同的调控作用。曾有研究[34-35]表明，HSCs是肝脏内一群特殊的MSCs，其本身细胞膜和分泌的膜微粒携带了MSCs所具有的特异性膜表面标记物CD105、CD44、CD29、CD13和CD90。研究[36]发现，该膜微粒也具有干祖细胞膜微粒所具有的促进肝再生的能力。在体外药物性肝损伤模型中，静止的HSCs膜微粒具有提高肝细胞增殖活力和抗凋亡的作用，还能减少转氨酶的释放，对肝脏具有保护作用。研究[37]表明，不同状态下的细胞所分泌的EVs所携带的内涵物可能有所不同，我们的后期研究发现，使用TGF-β1活化HSCs所收集到的膜微粒具有与静止HSCs来源的膜微粒完全相反的作用。活化的HSCs来源的膜微粒可下调PI3K-AKT信息通路蛋白和上调Caspase-3的表达，抑制肝细胞的增殖，促进损伤肝细胞的凋亡，加重药物性肝损伤。在接下来的研究中，我们会通过质谱分析、PCR和基因测序等重点研究两种不同状态的膜微粒内含物的不同之处，进一步阐明HSCs与肝细胞之间的分子机制。另外，研究[38-39]表明，非活化的HSCs可以通过外泌体向邻旁细胞转移miRNA-214，miRNA-214可直接作用于靶细胞结缔组织生长因子基因CNN2的3’末端，以抑制CNN2的表达，抑制肝纤维化；而SHEN等[40]则发现，在肝脏受到损伤时，HSCs被激活，表达的miRNA-214会减少，分泌含miRNA-214的囊泡也减少，其对CNN2的表达抑制能力下降，最终导致肝纤维化的发生。

3 总结与展望

EVs作为细胞间信息交流的重要载体，它所携带的蛋白质、mRNA和miRNA等通过一定的途径进入靶细胞后，可调节靶细胞的多种生物学行为。干细胞，包括肝外干祖细胞、肝脏干细胞和具有干细胞特性的HSCs所产生的EVs可向肝组织细胞传递多种细胞因子、mRNA和miRNA等，进一步调节肝细胞和HSCs内增殖、凋亡相关通路，最终影响肝再生。干细胞来源的EVs不仅具有促进肝细胞增殖和抗凋亡的作用，在损伤肝脏内其还具有抗炎作用。因此其在治疗方面有着巨大的潜力，为肝脏疾病的治疗提供了新思路；在肝损伤再生修复中，EVs不仅具有易制备及储存、稳定性高、定量使用等优点，还可以避免干细胞治疗所带来一系列问题如：免疫排斥、医源性肿瘤形成和外源性毒性物质的输入等，是一种具有较高安全性的生物制剂。

虽然干细胞来源的EVs在肝再生和肝损伤治疗方面展现出较好的使用前景，但其提存技术仍需进一步的提高和动物水平最适治疗浓度仍需深入探究。另外，干细胞在不同状态下所产生的EVs所含的内含物可能也有所不同，导致对肝再生具有不同的影响，因此，EVs所携带的内含物及其作用机理还需进一步阐释。

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