月季花黄酮类化合物的串联ESI-MS分析

云南开放大学/云南国防工业职业技术学院，云南 昆明 650223

月季花(RosachinensisJacq.)早期的药用记载出自李时珍《本草纲目》，又名月月红、四季花、月季红、四香春、艳雪红、勒泡，为蔷薇科蔷薇属植物，分布于全国大部分地区，主产于云南、广东、湖北和四川，全年均可采收[1]。月季花除具有观赏性之外，其药材为其干燥球形花蕾或微开的花朵，气清香，味淡和微苦。药理学研究表明月季的花、根和叶均可入药[2]。据报道月季花的主要活性成分为黄酮和酚酸类化合物，另外还有芳香油、鞣质和色素等[3-4]。中医认为其性味甘温，有活血调经、消肿解毒之功，主治月经不调、痛经、痈疮肿毒、淋巴结核等[3]。在民间月季花作为一种常用的活血化瘀药受到老百姓的欢迎，其中的黄酮苷类化合物具有很强的药理作用，例如槲皮素具有较强的抗肿瘤、抗病毒及抑制血小板聚集的作用[5-7]，山奈酚属于目前急缺的广谱抗菌中草药[8]，萹蓄苷具有利尿、抑菌杀虫和抗氧化的作用[9-11]。目前我省各地蔷薇科蔷薇属植物资源丰富，笔者研究这些化合物对于抗肿瘤、抗炎、抗衰老等药物的开发和利用具有一定的参考价值，同时研究代表药物月季花中黄酮类化合物的药理作用和机制等，为进一步开发利用蔷薇属植物奠定了基础。

本研究所运用的技术为电喷雾质谱(ESI-MS)，ESI-MS分析方法可获得相关物质的分子量、分子式及分子结构的重要信息[12]。其优点是分析快速、灵敏、分辨率高、样品用量少，而且分析范围广，可用于气体、液体、固体有机样品的分析，使复杂的有机混合物的分离与鉴定能快速的一次完成。质谱技术由于具有灵敏度高、分析速度快以及对杂质承受能力强等特点，已被广泛应用于分析复杂混合物[13]。笔者采用电喷雾质谱(ESI-MS)[14]，通过直接进样的方法对云南境内3种产地不同的月季花(弥勒、建水、安宁)新鲜花蕾样品进行分析[15]。由于产地不同，其化学成分也有一些差异[16]，因此建立一个微量和快速的定性及半定量分析方法，对不同产地的药材进行区分和辨别，对于正确合理使用该药材具有重要的意义。

1 仪器与材料

ThermoQuestFinnigan LCQDECA电喷雾离子源质谱检测器(ThermoQuest LC/MS Division, San Jose, CA, USA)。甲醇为分析纯试剂(广东光华化学厂有限公司)月季花分别采自弥勒、建水、安宁。

2 方法

2.1 溶液的制备 月季花各50 mg，浸泡于20 mL甲醇中，超声波提取30 min，离心后取上清液待测。

2.2 测试条件 负离子模式检测进行一级质谱及串联质谱分析。质谱检测器参数：雾化壳气为氮气(80uit)；雾化辅助气也为氮气(20uit)；毛细管温度：350℃；喷射电压：负离子模式下为4.5 kV；碰撞气为氮气；碰撞能量范围：30%～40%；所有数据采集和处理采用FinniganXcaliburTMCore Data System Rev.1.2。

3 结果与讨论

由于其他成分的负离子ESI-MS质谱响应不如黄酮类化合物，故在3个产地月季花提取物的负离子ESI-MS质谱图中(见图1-3)，主要见到的是一些黄酮及黄酮苷类化合物的准分子离子峰[M-H]-，而且这些准分子离子峰的丰度较高，碎片峰较少，干扰不大。在月季花的ESI-MS质谱图中主要的峰有m/z 447、301、169、609、615、285、463、599、433等。结合ESI-MSn推测这些准分子离子峰所对应的黄酮等化合物(见表1)。不同产地的月季花主要成分都很相近，比如在3种不同产地的月季花提取物的负离子质谱图中均可以检测到槲皮素、槲皮素-3-O-2″-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷、山萘酚-3-O-2″-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷，可见不同产地的月季花其主要黄酮成分大致相同。但是在一些微量成分上有一些差别，比如在弥勒和安宁产的月季花中均检测到槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷，但是在建水产的月季花中没有检测到；在建水和安宁产的月季花中均检测到槲皮素-3-O-6”-反式-香豆酰基-β-D-葡萄糖苷，但是在弥勒产的月季花中没有检测到；在建水产的月季花中有萹蓄苷，但是在弥勒和安宁产的月季花中均未检测到。从3个产地月季花提取物的质谱来看，除没食子酸外，槲皮素的峰都最强(基峰)。

分别对表1所列几个化合物的准分子离子峰作串联质谱(ESI-MSn)实验，进一步证明了黄酮苷类化合物的结构(见表2)，从而发现黄酮苷的裂解虽简单，但仍有规律可循。以月季花中含量最大的槲皮素为例具体分析，在ESI-MSn中得到m/z283、273、255、229和211等碎片离子，碎片m/z255可由碎片m/z283和273产生，槲皮素的裂解途径示于图4。另一个母核结构山奈酚在ESI-MSn中得到m/z267、257、229、211、169、151等碎片离子，其裂解途径示于图5。

表1 不同产地月季花ESI—MSn分析结果

峰号[M—H]-化合物ABC1 447槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷++2 301槲皮素+++3 169没食子酸++4 609槲皮素-3-O-6″-反式-香豆酰基-β-D-葡萄糖苷++5615槲皮素-3-O-2″-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷+++6285山萘酚++7463槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷+++8599山萘酚-3-O-2″-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷+++9433萹蓄苷+

*A：弥勒产月季花；B：建水产月季花；C：安宁产月季花；+ 表示出峰明显

表2 月季花中黄酮苷的ESI-MSn主要碎片信息

化合物化合物结构ESI-MS[M H]-ESI-MSn主要离子裂解方式(A、B、C、D、E途径见图4-5)槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷477301, -鼠李糖基283, B273, A229 A槲皮素301283, B273, A257, A255, A and B229, A211 A槲皮素-3-O-6-反式-香豆酰基-β-D-葡萄糖苷609463, -香豆酰基301, -葡萄糖基283, B257, A229 A槲皮素-3-O-2”-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷615463, -没食子酰基301 -葡萄糖基283, B273, A255, A and B229, A 山萘酚285267, D257, C229, C211, C169, E151, E

槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷463301, -半乳糖基283, B273, A255, A and B229 A萹蓄苷433301, -阿拉伯糖基283, B273, A255, A and B229 A

综上，通过月季花的甲醇总提取物直接进样法的ESI-MSn快速分析，建立了一种快速分析方法。对总提物进行定性和半定量分析，能够快速简便地判断不同产地月季花药材的品质，预判药材的化学成分。