致孔剂溶解度参数对大孔层析介质的结构影响研究

兰梦菲

摘 要 分别以甲基丙烯酸缩水甘油醚酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯为功能单体和交联剂，采用悬浮聚合方法制备了大孔聚合物微球。考察了致孔剂的组成及用量对微球的孔径、比表面积的影响，其中随着致孔剂中的良溶剂（二氯甲烷 δ=9.7 （cal/cm3）1/2）和不良溶剂（正辛醇δ=10.3 （cal/cm3）1/2的比例变化，致孔剂体系溶解度参数可调范围为9.89～10.09 （cal/cm3）1/2），随着致孔剂与聚合物之间溶解度差值的增加，微球的孔径随之增大而比表面积呈下降趋势。将此类微球偶联聚乙烯亚胺衍生为阴离子交换层析介质，以前沿分析法比较了不同孔径的微球的传质性能，其中孔径为257 nm的介质仍能保持较高的动态蛋白载量（45.1 mg/mL），表明此类大孔介质在高通量分离纯化应用方面具有很大潜力。

关键词 致孔剂； 溶解度参数； 大孔微球； 蛋白质； 分离

1 引 言

人们对生物制品的需求日益增加，促使生物制药生产规模不断增加，如何高效地获得符合要求的生物产品，是下游分离纯化技术所面对的挑战，因此发展高通量的分离分析方法势在必行。层析分离作为一种主流技术在蛋白分离纯化中占有重要地位，其中色谱层析介质是分离柱的核心。当前以琼脂糖为基质的介质应用广泛，具有生物相容性好、化学稳定性高等优点，但其缺乏机械刚性、耐压性差（通常<0.3 MPa）、孔径小[1]（孔径范围在3～50 nm之间），尤其在分离大尺寸生物分子，如病毒、类病毒颗粒时，表现出载量低、通量小的不足。而具有大孔结构的聚合物层析介质机械强度高（可耐受10 MPa以上压力）、孔径尺寸大（>100 nm），更适合大尺寸分子的传质，能够满足快速、高通量分离纯化的需求，可弥补这些不足[2]。

以琼脂糖为基质的介质多以悬浮自由基聚合制备而成，控制微球结构从而获得贯通孔是制备难点。二十世纪九十年代初出现的颗粒内以对流传质为特征的灌注色谱填料（POROS 系列）[3]，其最大特点为同时具有贯通孔（500～800 nm）和扩散孔（20～100 nm），在保证蛋白分子快速传质的同时具有较高的蛋白载量。这种介质制备过程中先形成纳米粒子，然后粒子间进行团聚从而得到大孔微球，因其制孔过程复杂而难以准确控制[4]。Sun研究组[5，6]采用碳酸钙颗粒和有机溶剂作为致孔剂制备超大孔PGMA微球，得到具有102 nm孔径微球，但由于无机颗粒与有机聚合物的相容性较差，所得微球的贯通孔不易均匀控制； Zhou等[7，8]研究了以反胶团溶胀法制备聚丙烯酸酯类和苯乙烯类为基质的超大孔层析介质。以上两种方法均是通过设计不同的致孔剂，从而制得贯通孔结构。该类大孔聚合物微球对蛋白大分子有着较好的传质性能，但同时其比表面积会显著降低，甚至低于10 m2/g，介质的蛋白载量难以提升[9，10]。本课题组前期工作中采用原子转移自由基聚合方式制备大孔聚丙烯酸酯类微球，具有200～300 nm的贯通孔[11，12]，同时具有较高的比表面积，在调控孔径及比表面积的过程中发现，致孔剂对于微球结构的影响最为显著，但对其影响规律未做进一步研究。

本研究仍分别以甲基丙烯酸缩水甘油醚酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯为功能单体和交联剂，在传统悬浮聚合体系中，系统研究了致孔剂组成及用量对微球的结构包括孔径大小、比表面积、表面形貌、蛋白载量等的影响，探索了溶解度参数与微球结构之间的规律关系。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

FEI Quanta400F扫描電子显微镜（美国FEI公司）； Autopore IV9500压汞仪（美国Micromeritics公司），VSorb 2800比表面积测定仪（南京金埃谱公司）； KTA Purifier 10 蛋白层析系统（美国GE公司）。

甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA，纯度98%）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，纯度98%）、聚乙烯醇（PVA，醇解度87%，平均聚合度1700）、聚乙烯亚胺（PEI分子量600）均为试剂纯（阿拉丁试剂公司）； 偶氮二异丁腈（AIBN，分析纯）、二氯甲烷（DCM，分析纯）、正辛醇（OA，分析纯）、十二烷基苯磺酸钠（SDS，纯度99%），国药集团； 牛血清白蛋白（BSA，试剂级，纯度>98%，美国SigmaAldrich公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 大孔聚合物微球的制备 介质采用悬浮聚合方法制备，其反应过程如图1所示，具体实验步骤如下：（1）配制水相：称取10 g PVA、1.0 g SDS加入1000 mL去离子水中，水浴加热至80℃，在磁力搅拌下至完全溶解成透明溶液，冷却至室温，备用； （2）配制油相：称取0.040 g AIBN加入25 mL三角瓶中，然后再依次加入1.0 mL GMA、1.0 mL EDMA、1.5 mL二氯甲烷、1.5 mL正辛醇，在室温下振荡15 min混合均匀； （3）在通入氮气的条件下，将油相缓慢滴入水相中， 200 r/min搅拌，滴加完毕后，升温至60℃反应8 h，聚合完毕后，将溶液进行抽滤，然后放入索氏提取器，用丙酮抽提24 h，取出在50℃下真空干燥24 h后，室温下存放，备用。

2.2.2 阴离子交换介质的衍生及离子交换容量的测定 阴离子交换介质的制备过程参照文献[13]方法： 称取5.0 g干燥的自制大孔微球（PGMAEDMA）置于250 mL三口瓶中，然后依次加入50 mL二甲基亚砜和5.0 g聚乙烯亚胺，搅拌混合均匀后加热至60℃，反应24 h，反应完毕后，将溶液抽滤，并用去离子水洗涤至无色，然后放入玻璃层析柱中测定其离子交换容量[14]，其具体操作如下：（1）首先用30 mL 1.0 mol/L NaOH溶液将介质转型为OH型； （2）将去离子水通入层析柱中，清洗介质至流出液为中性； （3）准确量取50 mL 0.10 mol/L加入层析柱中，并同时收集流出液体； （4）向层析柱中加入30 mL 1.0 mol/L NaCl溶液，将此收集液与步骤（3）的收集液合并； （5）用标准HCl溶液滴定收集液，根据下式计算介质的离子交换容量Q。endprint

2.2.3 前沿分析法测定层析介质的蛋白载量 取1.0 mL PGMAEDMAPEI介质装入层析柱管（Φ 10 mm×13 mm）中，将此柱子连接于AKTA Purifier 10蛋白层析系统中。以50 mmol/L TrisHCl缓冲溶液（pH=8.0）为平衡液A，以1.0 mol/L NaCl TrisHCl缓冲溶液（pH=8.0）为洗脱液B，并用平衡液A配制 1.0 mg/mL BSA溶液。色谱条件如下：设定操作流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，先平衡层析柱10 mL（即10 柱体积，10CV），然后用泵头上样方式开始吸附BSA，100%流穿后再以平衡液A冲洗层析柱至基线，最后以洗脱液B洗脱吸附蛋白，根据流穿体积计算介质动态吸附载量。

3 结果与讨论

3.1 致孔剂中两组分的比例对微球形貌的影响

致孔剂对多孔材料的成孔起着至关重要的作用。首先考察了致孔剂中两种组分的不同比例组成对微球形貌的影响，固定致孔剂的体积用量，改变两种组分之间的比例。其中二氯甲烷（DCM，δ=9.7 （cal/cm3）1/2）为良溶剂，正辛醇（OA，δ=10.3 （cal/cm3）1/2）为不良溶剂，PGMAEDMA微球的溶解度参数参照聚甲基丙烯酸甲酯拟定为9.3（cal/cm3）1/2，以上有关溶解度参数均参照文献[15]的数值，致孔剂二者的体积组成比例分别为2∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2（对应的溶解度参数依次为9.89、10.0、10.06、10.09 （cal/cm3）1/2），不同比例下的表面形貌变化如图2所示，DCM/OA为2∶1时（A1和A2）微球表面致密，几乎无孔； 当降低DCM用量，DCM/OA为1∶1时（B1和B2），微球表面开始变得粗糙，放大5000倍下的SEM图（B2）出现100 nm以内的大孔； 继续降低DCM用量，二者比例为1∶1.5时（C1和C2），微球表面的孔径增大至200～300 nm； 随着DCM用量进一步减少，当下降为DCM/OA=1∶2时（D1和D2），微球表面粗糙度显著，大孔尺寸及数量均明显增加，孔之间的通透性增加；继续减少DCM的用量（DCM/OA=1∶3），微球破碎严重。微球的表面形貌分析表明，不良溶剂OA用量的增大对形成大孔有促进作用，而良溶剂DCM有利于微球的成球或者机械强度的提高，此趋势与普通的多孔聚合物材料制备规律相似[16]。

3.2 致孔剂体系的溶解度參数对微球内部结构的影响

不同比例的致孔剂体系的溶解度参数以及所对应微球的孔径及比表面积如表1所示。致孔剂体系的溶解度参数由9.89 （Cal/cm3）1/2增加到10.09 （Cal/cm3）1/2所对应的微球孔径呈增大趋势，最大平均孔径可达（257.0±0.2） nm，相反，对应的比表面积为下降趋势，从（134±1） m2/g下降至（47±1） m2/g。通常认为聚合物的溶解度参数值与溶剂的溶解度参数值越接近时，聚合物越倾向于溶解其中[17]。致孔剂体系与PGMAEDMA微球之间的溶解度差值显示致孔剂与PGMAEDMA的相容性优劣，进而影响微球的结构有一定影响，其影响见图3和图4。由溶解度参数差值Δδ对孔径的影响趋势图（图3）可见，随着差值的增加，微球孔径呈上升趋势，而其比表面积则相反呈下降趋势（图4）。究其原因，溶解度差值Δδ越大，致孔剂与聚合物之间的相容性越差，在聚合过程中生成的聚合物与致孔剂之间的相分离发生的越早，后期聚合物在早期析出的核上继续生长，形成的聚集颗粒尺寸偏大，聚集颗粒尺寸越大则颗粒间的空隙也随之增大，因此，最后形成了较大的孔径。与此同时，聚集颗粒尺寸越大则对应的比表面积则越低，故微球的比表面积变化呈相反趋势。

3.3 不同结构微球的蛋白动态载量测定

将不同孔径的微球衍生后制备得到阴离子交换介质（PGMAEDMAPEI），分别测定了其离子交换容量和动态蛋白载量值。从表2可见，随着介质孔径的增加（21～257 nm），离子交换容量稍有下降，主要是由于介质的比表面积降低，致使介质表面偶联PEI配基的量减少，但此影响并不显著，介质的离子交换容量均保持在0.35 mmol/mL以上。可能是介质的比表面积虽然降低，但相应的孔径的增加降低了大分子配基PEI的传质以及反应位阻，故最终对偶联PEI的数量没有显著影响。

比较了不同孔径结构的PGMAEDMAPEI的动态载量，通常介质孔径的增大有利于蛋白大分子的传质，但由于比表面积降低，蛋白载量也会降低，从表2可知，介质的动态载量随着孔径的增加呈下降趋势，从61.4 mg/mL下降至45.1 mg/mL，下降幅度为26.5%，但远小于比表面积下降幅度（64.9%），表明此类大孔介质一定程度上能够保持较高载量。

4 结 论

本研究采用悬浮聚合方法制备了甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚的大孔微球，考察了致孔剂的溶解度参数对微球结构的影响。结果表明，随着致孔剂中不良溶剂比例的增大，微球的孔径随之增加，同时比表面积呈现下降趋势。致孔剂体系与聚合物之间的溶解度参数差值越小，微球的孔径越小， 比表面积越大，相应的蛋白载量越高。本研究为聚合物层析介质的制备提供了参考。

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Abstract The macroporous microspheres were prepared through suspension polymerization and based on a copolymer of glycidyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate. The effect of porogen on the microspheres structure was evaluated in terms of pore size and surface area. Porogen contained dichloromethane （δ=9.7 （cal/cm3）1/2） and Noctanol （δ=10.3 （cal/cm3）1/2） which corresponded to a good and poor solvent， respectively. The solubility parameter of porogen was controlled in the range of 9.89-10.09 （cal/cm3）1/2. The pore size of microspheres increased with the difference value of solubility parameter between the polymer and the porogen. On the contrary， the surface area of microspheres decreased in this study. The anion exchange media was prepared through coupling poly（ethylene imine） in the microspheres， and the proteins transport was determined by frontal analysis method. The macroporous microspheres with 257 nm pore size could still afford a high proteins capacity （45.1 mg/mL）. These macroporous supports showed a large potential in a rapid separation of proteins.

Keywords Porogen； Solubility parameter； Macroporous microspheres； Protein； Separation

（Received 7 October 2017； accepted 21 November 2017）

This work was supported by Beijing Natural Science Foundation， China （No. 2162013）.endprint