基于代谢组学方法的小儿肺炎易感性研究

摘 要 以6个月到6岁肺炎患儿尿液为样本，采用基于气相色谱与质谱联用技术（GCMS）的代谢组学方法，研究肺炎患儿尿液内源性代谢产物的变化及其易感性的发病机制。收集不同感染次数的肺炎患儿尿液样本，包括正常儿童组29例、 单次感染肺炎患儿组35 例、 多次感染肺炎患儿组31例，分析获得肺炎患儿尿液代谢轮廓； 同时对所得数据进行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判别分析（PLSDA）等多元统计分析，综合单因素方差分析及倍数（Fold change，FC）变化分析结果，最终筛选并通过FiehnLib等数据库鉴定丝氨酸、 组氨酸、 脯氨酸、 正亮氨酸、 谷氨酰胺、 硬脂酸、 缬氨酸和异亮氨酸、 乳糖醛酸等在正常儿童组与肺炎患儿组之间有代谢差异（p value adjusted by FDR<0.05）且FC>5，吲哚3乙酸、 肌酸、 乙醇胺、 甘露糖基甘油酸和果糖在不同感染次数肺炎组之间具有差异性（p value adjusted by FDR<0.05）。实验结果表明，肺炎患儿易感性体质存在差异性代谢物，这些代谢物主要通过氨基酸及糖代谢对肺炎易感性产生影响。

关键词 小儿肺炎； 易感性； 代谢组学； 气相色谱质谱联用

1 引 言

肺炎是儿科常见病。世界卫生组织（WHO）将小儿肺炎列为全球3种重要儿科疾病之一，肺炎死亡数占全世界各种原因死亡总数的5%[1]，每年全球大约有100万5岁以下的儿童死于小儿肺炎，是发展中国家5 岁以下小儿死亡的主要原因[2]，故加强对肺炎的防治十分重要。

随着系统生物医学思维模式的建立，现代医学的研究正由微观、 实体的探索向宏观、 系统的角度转变，现代研究融入当前系统生物学将是必然的趋势。代谢组学做为系统生物学的代表之一，运用高通量技术，如气相色谱与质谱联用技术（GCMS）、 液相色谱与质谱联用技术（LCMS）等，研究生命体代谢产物的变化规律，揭示机体代谢的本质[3，4]。近年来，尿液代谢组学的临床及实验研究越来越多，部分研究基于液相色谱质谱技术探讨疾病的尿液代谢特征谱，涉及嘧啶代谢、 氨基酸代谢、 嘌呤代谢等[5～9]，且尿液为非创伤性诊疗措施，尿样本采集难度较低，适用于成人及小儿临床疾病特征谱的探索。

近年来，已有对小儿肺炎分子水平上的代谢组学研究报道[10，11]。Lu等[12]研究发现H1N1流感病毒感染肺炎患者血清内多种代谢途径发生改变，以花生四烯酸代谢通路中的内源性物质改变最显著，也可能与一些内源性氧化还原物质如谷胱甘肽的代谢紊乱有关[13，14]。本研究采用GCMS技术，研究小儿肺炎的代谢特征，以小儿肺炎晨尿样本为例，从尿液代谢角度出发，探讨了小儿肺炎易感性的物质基础，研究并揭示基于代谢组学的小儿肺炎易感性体质的可能的生物学机制。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

配备AS 1310 自动进样器的Trace 1310 气相色谱和TSQ 8000 质谱仪、 TG5MS 气相色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、 Speed Vac 离心浓缩仪（Thermo公司）； Allegra 64R centrifuge 离心机（美国Beckman Coulter公司）； CPA225D电子天平（德国Sartorius公司）。

1，213C肉蔻酸（1g）、 BSTFA （含1% TMCS，10 mL）、 C8～C40 烷烃系列标准品（1 mL）、 吡啶（100 mL）和甲氧胺盐（50 mg）均购于Sigma 公司。11种标准品包括组氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸、 硬脂酸、 缬氨酸、 异亮氨酸、 赖氨酸、 苏氨酸、 谷氨酸、 次黄嘌呤、 肌酸（50～100 mg， Sigma 公司）。

2.2 样品采集与制备

2.2.1 肺炎诊断标准 参照《诸福棠实用儿科学》第8版制订肺炎诊断标准[2]，选择病例。（1）纳入标准 符合上述肺炎诊断标准的6月～6岁住院患儿及正常儿童。（2）排除标准 有明确先天/后天遗传代谢障碍疾病者。入选时有心力衰竭、 呼吸衰竭、 中毒性脑病、 渗出性胸膜炎等严重合并症者。合并有心脑血管、 肝肾和造血系统等严重原发性疾病及精神病患者。

2.2.2 样品采集 本研究经南京中医药大学附属医院（江苏省中医院）伦理委员会批准，纳入病例均获得患儿家属知情同意。选取2014年1～4月在首都医科大学附属北京儿童医院住院部确诊为肺炎的6月～6岁患儿及儿童保健科采集6月～6岁正常儿童的晨尿。 共纳入正常儿童（NC）组29例，单次感染肺炎（FIP）組35例，多次感染肺炎（RIP）组31例，临床资料见表1。3组间儿童年龄、 性别、 身高、 体重无统计学差异（p>0.05），而肺炎组的血常规（白细胞计数、 中性粒细胞、 淋巴细胞）、 用药情况与正常组存在差异，有统计意义（p<0.05）。由表1可知，学龄前期正常儿童的血常规中淋巴细胞比重较高。肺炎组儿童血常规中性粒细胞比重较正常儿童组高，淋巴细胞比重较正常儿童组低，说明本项研究纳入肺炎患儿以细菌感染占主导地位，符合肺炎的发病规律[2]。留取晨起空腹第一次尿液的中段尿液约2 mL，于 80℃保存，避免反复冻融。

2.2.3 样品制备 （1）尿样处理 将尿液样本置于4℃（或冰上）融化，14000 r/min离心10 min，取上清180 μL，加入含30U尿素酶溶液20 μL， 37℃孵育30 min，然后加入800 μL甲醇（冰浴，甲醇内含1 mg/mL的内标1，213C肉蔻酸），涡旋10 min， 4℃ 12000 r/min离心10 min，吸取200 μL上清液，置于离心浓缩仪中挥干2 h。（2）样品衍生化 向尿液样本中均加入15 mg/mL甲氧胺吡啶溶液30 μL，涡旋 1 min 后振荡 1.5 h，混匀5 min，加入30 μL BSTFA（含1% TMCS）溶液后，涡旋1 min，后振荡0.5 h （37℃，600 r/min）。静置，吸取上清液60 μL于玻璃内插管中，供GCMS进样分析[15]。endprint

2.3 色谱质谱仪条件

载气为氦气，流速为1.2 mL/min，采用分流模式，进样口温度250℃，分流比为20∶1，升温程序： 起始温度60℃，保持1 min 后，以20℃/min 升至320℃后，保持5 min； 进样量为1 μL。采用EI 源； 离子源温度为280℃，离子传输线温度为250℃，电离能为70 eV，采集范围为m/z 50～500，采集时间3.5～19.0 min[16]。

2.4 数据处理及统计学方法

采集各样品的图谱信息，使用MSDIAL及FiehnLib数据库[17，18]对得到的原始资料进行预处理，通过峰提取、 物质鉴定、 峰对齐，得到三维矩阵数据集，坐标分别为：化合物名称、 保留时间、 保留指数及根据峰高提取的峰面积（Peak height）。对矩阵数据集进行总离子流校准（mTIC normalization）及Pareto 校准后（Pareto scalling），采用Metaboanalyst 3.0[19]进行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判别（PLSDA）等多元统计分析。接着对数据进行对数转换（log2x transformation）后，基本满足正态分布及方差齐性后，进行单因素方差分析。根据FC及单因素方差分析所得的p值及False discovery rate （FDR）值筛选差异性代谢物，当FC >1.5及p<0.05时，提示该代谢物具有统计学意义。使用NIST 2014 数据库和已有标准品对其进行验证，并经Metaboanalyst3.0分析相关代谢通路。

3 结果与讨论

3.1 GCMS分析结果

正常儿童组，单次感染肺炎组及多次感染肺炎组的GCMS分析总离子流图（TIC）见图1。使用MSDIAL及FiehnLib数据库[17，18]，将保留指数与保留时间进行线性匹对，共筛选出159种化合物，包括丝氨酸等氨基酸、 半乳糖等糖类、 琥珀酸等小分子代谢物。以内标（1，213 C肉蔻酸）及C8～C40烷烃作为质控标准，保留指数及峰面积RSD均控制在30%以内。

3.2 肺炎代谢轮廓分析及差异性代谢物鉴定

采用MSDIAL处理尿液中筛选的色谱峰，再进行PCA及PLSDA分析， 由PLSDA得分图（图2）可见，正常儿童组与肺炎患儿组区别性比较好，肺炎组之间能够良好区分，提示正常儿童组及不同感染次数的肺炎患儿组尿液的确存在代谢差异，通过FC>1.5及单因素方差分析（p<0.05）筛选，共找出对得分图区分做出主要贡献的差异性代谢物共62种，并用标准品对组氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸、 硬脂酸、 缬氨酸、 异亮氨酸、 赖氨酸、 苏氨酸、 谷氨酸、 次黄嘌呤、 肌酸共11种物质进行了确认（图3）。同时通过Cytoscape得到网络关系图（见电子版文后支持信息图S1）。

3.3 代谢通路分析

使用MetaboAnalyst3.0进行代谢通路分析。根据通路影响值及p值得到：（1）丙氨酸、 天冬氨酸和谷氨酸代谢，（2）甘氨酸、 丝氨酸和苏氨酸代谢，（3）色氨酸代谢，（4）氨基酰tRNA生物合成，（5） 精氨酸和脯氨酸代谢，（6） 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，（7） 淀粉和蔗糖代谢，（8） 嘌呤代谢，（9） 缬氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸生物合成，共9条相关代谢通路（富集分析p value<0.05， Impactor factor>0.02）。上述通路与差异性代谢物之间的关系见图4。

氨基酸类差异性代谢物（组氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸、 亮氨酸、 異亮氨酸、 硬脂酸、 天冬酰胺，赖氨酸、 苏氨酸、 色氨酸、 酪氨酸和缬氨酸等）在肺炎患儿组相对含量上升，糖类差异性代谢物（半乳糖醛酸、 L二硫苏糖醇、 纤维二糖）在肺炎患儿组相对含量下降。不同感染次数肺炎患儿组与正常儿童组之间尿液差异性代谢物的相对含量变化（见电子版文后支持信息图S2）。

对比肺炎患儿组与正常儿童组可知，肺炎过程中机体能量供应受损，需要氨基酸代谢和糖代谢参与修复。氨基酸类代谢物主要参与蛋白质的转运，肺炎过程中蛋白质不断分解为氨基酸，氨基酸的氧化代谢及糖类物质的消耗，进而提供能量[20～23]，参与机体修复。组氨酸及其代谢产物组胺是肺炎、 哮喘等呼吸系统疾病的主要致炎因子[24]，组氨酸在肺炎组的相对含量上升，代表肺炎正处于炎症急性期，组氨酸不断累积并及时参与到炎症反应中。组氨酸还可以不断转化成谷氨酸及谷氨酰胺，同时谷氨酰胺不断代谢为次黄嘌呤，黄嘌呤、 黄嘌呤核苷、 组氨酸及其代谢物的累积代表体内能量及代谢失衡。丝氨酸是色氨酸的前体，丝氨酸可以不断转化成色氨酸，甲硫氨酸等。在代谢网络调控中，色氨酸有两条主要代谢途径：犬尿氨酸代谢和5羟色胺代谢。色氨酸犬尿氨酸通路在多种疾病中发挥作用[25，26]。色氨酸代谢主要发生于炎症组织，肺炎急性期时，色氨酸和产物犬尿氨酸不断在尿液中代谢累积[27]。多次感染肺炎患儿组与单次感染肺炎患儿组对比，存在以下5种差异性物质：肌酸、 乙醇胺、 吲哚3乙酸、 β甘露糖基甘油酯等物质相对含量上升，这些物质均为氨基酸代谢产物，伴随糖酵解（半乳糖醛酸、 L二硫苏糖醇、 纤维二糖、 果糖），此类代谢底物在尿液中含量累积及代谢，可以作为肺炎急性期感染期及易感性的标记物。

4 结 论

采用GCMS与PLSDA方法分析不同感染次数肺炎患儿与正常儿童之间的尿液差异性代谢产物的变化，氨基酸类差异性代谢物，如组氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸、 正亮氨酸、 硬脂酸等物质在肺炎组明显上升； 糖类差异性代谢物，如半乳糖醛酸、 L二硫苏糖醇、 纤维二糖含量在肺炎组明显下降。经Metaboanalyst分析得到共9条相关代谢通路。表明儿童肺炎主要影响氨基酸及糖代谢，推测肺炎引起了儿童机体的氨基酸代谢及糖代谢紊乱。本研究的样本来源尿液为无创性诊疗手段，易于获取及采集，利用尿液代谢组学的方法评估及区分正常儿童与肺炎患儿及不同感染次数的肺炎患儿的代谢差异，可为临床肺炎急性发作期及肺炎易感性提供依据。endprint

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Abstract The changes of endogenous metabolites in urine samples that come from pneumonia patients of 6 months to 6 years old children were analyzed by metabolomics methods based on gas chromatography and mass spectrometry （GCMS）. The aim of this study was to analyze and study the pathogenesis of endogenous metabolites in children with pneumonia and the pathogenesis of pneumonia susceptibility. The urine samples were collected and divided into normal children group （NC group， n=29）， first infection with pneumonia group （FIP group， n=35）， and repeated infection with pneumonia group （RIP group， n=31）. The urine metabolic profile of pneumonia was obtained by GCMS. Principal component analysis （PCA） and partial least squaresdiscriminant analysis （PLSDA） were used to analyze the data. The results were analyzed by oneway analysis of variance and Fold change. Finally， there was significant difference between the normal group and the pneumonia group， the significant metabolites were serine， histidine， proline， norleucine， glutamine， stearic acid， valine， isoleucine with p value<0.05 and Fold change>5， and indole3acetic acid， creatine， ethanolamine， mannosylglycerol and fructose were significant between the two pneumonia groups with p value<0.05. The urinary metabolites demonstrated that amino acid metabolism and glucose metabolism were the main metabolic pathways and responsible for the susceptibility to pneumonia.

Keywords Pneumonia inchildren； Susceptibility； Metabolomics； Gas chromatographymass spectrometry

（Received 12 September 2017； accepted 22 December 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.81373688）， the Postgraduate Research and Innovation Project of Colleges and Universities of Jiangsu Province （No.SJLX_0432）， Jiangsu Provincial 333 Highlevel Talents Cultivation Project （No.BRA2016427）， and Jiangsu Provincial Six Talent Peaks Project （No.YY022）.endprint