多菌灵与3种环糊精的识别研究

孙伟厍

摘 要 利用溶液法制备了疏水性药物分子多菌灵与β环糊精、2羟丙基β环糊精和2，6二甲基β环糊精的包合物，在25℃时，通过核磁共振实验氢谱、二维ROESY和扩散排序DOSY的实验方法对多菌灵与3种环糊精的识别进行研究，得出了包合物的可能包合形式和3种环糊精与多菌灵包合后的扩散系数分别为DβCD=2.516×10 10 m2/s，D2HpβCD=1.676×10 10 m2/s，DMeβCD=2.046×10 10 m2/s； 通过X射线粉末衍射、热重分析、红外光谱和扫描电镜发现，形成包合物后，环糊精和多菌灵的特征衍射峰均发生了变化，多菌灵的特征衍射峰10.4°，21.2°，25.8°，31.5° （2θ）消失或减弱； 多菌灵热分解温度197.5℃，形成包合物后热分解温度提高到260℃以上； 红外光谱的结果也表明，形成包合物后，环糊精空腔内的水峰振动明显减弱，说明环糊精的疏水空腔中水分子位置被多菌灵分子占据； 扫描电镜的结果表明，包合物的外观不同于单体，说明有新的物相生成。

关键词 多菌灵； 环糊精； 核磁共振； 包合物

1 引 言

多菌灵（Carbendazim， MBC）又名苯并咪唑44号[1]，是一种高效、低毒、广谱的内吸性杀菌剂，其主要作用机制是通过活性苯并咪唑部位抑制DNA合成，从而抑制菌体的生物合成。多菌灵能够有效防治由多种真菌引起的病害，如西红柿枯萎病、蔬菜苗期立枯病、猝倒病、 瓜类白粉病、豆类炭疽病等。由于多菌灵不溶于水，作为农药使用时一般被制成可湿性粉剂，悬浮剂，或水分散粒剂，因此在使用过程中残留量大、利用率低，易对土壤造成污染[2，3]。

环糊精[4]具有特殊的疏水空腔，可以包合与之空腔尺寸相匹配的客体小分子，形成的包合物是一种特殊类型的分子复合物，其疏水空腔可以包合客体分子的疏水部分，改变客体小分子的物化性质[5，6]。多菌灵是疏水性有机小分子，其分子大小与环糊精空腔尺寸匹配，使用环糊精对其进行包合能够有效改变客体分子多菌灵的物化性质，提高其水溶性和生物利用度，降低对环境的污染。

核磁共振（NMR）在分子识别的研究方面具有很多优点，它可以在近似生理环境下对样品进行无损检测，测试方法具有多样性，如一维氢谱、碳谱[7]、二维旋转坐标系NOE谱（ROESY）[8，9]、扩散排序实验（DOSY）等[10]，能够提供丰富的实验参数，如化学位移、耦合常数、质子强度、弛豫时间和扩散系数等。同时，核磁共振方法在确定主客体空间构型中具有十分重要的作用。

已有文献报道使用荧光方法研究MBC与环糊精包合物在溶液状态下的识别现象，并采用热重（TG） [11，12]、 X射线粉末衍射（XRD） [13，14]、红外光谱（IR） [15，16]和扫描电镜（SEM）等方法研究固体包合物的性质。

本研究采用溶液法制备了MBC与β环糊精（βCD）、2羟丙基β环糊精（2HpβCD）和2，6二甲基β环糊精（MeβCD）的包合物，通过1H NMR分析了MBC进入环糊精空腔后的主客体化学位移变化，利用2D ROESY分析了包合物可能的空间构型，对其可能的作用点进行了分析和讨论，多菌灵和环糊精的分子结构见图1。此外，利用2D DOSY的实验方法对包合物的扩散系数进行了测试，利用热重（TG）、 X射线粉末衍射（XRD）、红外光谱（IR）和扫描电镜（SEM）的方法，对包合物的性质进行了研究。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

AVANCE III 400MHz超导核磁共振仪（德国Bruker公司）； STA 449C热重分析仪（德国Netzsch公司驰）； D/MAX3C粉末衍射仪（日本Rigaku公司）； EQUINOX55红外光谱仪（德国Bruker公司）； S570扫描电镜（日本Hitachi公司）； BSA124S分析天平（德国Sartorius公司）； SENCOR旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）； KQ3200ED超声波振荡器（昆山市超声波仪器有限公司）； RCT basic磁力搅拌器（德国IKA公司）； 1011AB电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）； FGJ10c冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。

MBC （纯度>98%）、βCD（分子量=1135）、2HpβCD （分子量=1542，DS=5.5）和MeβCD （分子量=1310，DS=12）均购买于上海阿拉丁生物技术有限公司； 核磁试管（Φ5 mm， ST500， NORELL）； D2O （D，99.8%， CIL）、DMSO （D，99.8%， CIL）、无水乙醇（分析纯，天津富宇精细化工有限公司）。

2.2 实验方法

NMR实验由BBO5mm多核宽带探头测试，配控温单元（VTU），实验温度（293 ± 0.1） K，样品溶于D2O，以溶剂残留峰为化学位移定标标准。1H NMR工作频率为400.13，H谱宽为8012.82 Hz，1H谱脉冲宽度9.6 μs，采用zg30脉冲序列，采样点数65536，采样次数16次，延迟时间1 s； 2D ROESY采用儀器自带标准脉冲序列，F2 （1H）和F1 （1H）维的谱宽均为3616.1 Hz，混合时间0.8 s，采样数据点阵t2 × t1=2048 × 256； DOSY实验采用Ledbpgp2s脉冲序列，梯度场分16步由2%递增到95%，谱宽均为5208.33 Hz， 采样次数16次，空扫次数4次，延迟时间1 s； DOSY实验数据采用Topspin3.2软件进行数据拟合，其它实验数据使用MestReNova 7.1软件进行绘图。

MBC、βCD、 2HpβCD、 MeβCD、 物理混合物、 包合物XRD分析均用Cu靶，Kα（λ=0.15406 nm） 电流35 mA，激发电压35 kV， 2θ扫描范围5°～50°， 扫描速度4°/min，步长0.02°/min。endprint

对于热重分析，MBC、 βCD、 2HpβCD 、 MeβCD、 物理混合物、 包合物分别进行研磨，制样。实验起始温度： 35℃，10℃/min程序升温至600℃，氮气保护。氮气作为保护气流，流速40 mL/min，升温速率10℃/min，温度范围30～600℃。

IR光谱测定采用KBr压片，置于傅立叶变换红外光谱仪检测器中进行测定，扫描波数范围为4000～500 cm1。SEM扫描采用喷金方法，激发电压20 kV，放大倍数500倍。

2.3 多菌灵与环糊精包合物的制备方法

称取0.5 mmol 环糊精至30 mL二次蒸馏水中，将0.5 mmol MBC溶于20 mL无水乙醇中。 使用100 mL 三颈瓶，控制反应温度40℃，搅拌速度500 r/min，将MBC的乙醇溶液缓慢滴加到环糊精溶液中，滴加完成后，升温至60℃，搅拌24 h，恢复室温继续搅拌12 h，减压蒸馏除去大部分乙醇，静置过夜，采用冷冻干燥法，得到类白色疏松固体包合物。

3 结果与讨论

3.1 1H NMR的分析

MBC的1H NMR如图2所示， δ 3.755是一个单峰，归属为H10甲基质子， δ 7.387～7.409是苯環上H4/H7质子， δ 7.060～7.083是苯环上H5/H6质子， δ 11.649是活泼氢NH。

MBC不溶于水，使用D2O作溶剂时，在氢谱中有MBC苯环区的特征峰出现； 同时，环糊精的腔内质子不同程度向高场移动，峰型发生改变，说明MBC与环糊精形成了包合物，增大了MBC的水溶性。环糊精的腔内质子H3和H5受到MBC苯环的各向异性效应影响，化学位移向高场移动，3种环糊精质子包合前后的化学位移变化见表1。如图3所示，与环糊精形成包合物后，MBC苯环区质子H4/H7与H5/H6峰型变钝，底部变宽，两组峰之间的距离发生变化： MBCβCD包合物，两峰之间的距离由包合前的Δδ 0.326变化到Δδ 0.165； MBC2HpβCD包合物，两峰之间的距离变化到Δδ 0.175； MBCMeβCD包合物，两峰之间的距离变化到Δδ 0.133。MBC不溶于水，无法将MBC游离态与包合态的化学位移变化进行比较，但仍能够通过MBC自身质子的化学变化说明形成包合物后所产生的变化。

3.2 2D ROESY分析

MBC的苯环区质子与βCD的H3和H5有相关峰（图4），而MBC与βCD的环外质子H2和H4没有相关峰，说明MBC的苯环进入到了βCD的空腔内，二者之间的空间距离较近，MBC的H4/H7与βCD的H3和H5都有相关峰，而MBC的H5/H6只与βCD的H5有相关峰，说明MBC进入到βCD空腔较深，MBC的苯环位于βCD空腔的中间位置，从图4中没有观察到MBC的甲基与βCD的相关峰，这可能是由于该部分没有进入到βCD的空腔，仍留在空腔的大口端外部，2HpβCD和MeβCD与MBC的ROESY谱图见附录图1和图2（见电子版文后支持信息）， 由此得出MBC与3种环糊精的可能包合形式如图5所示。

3.4 TG分析

从图7可见，βCD有两个失重阶段，第一个阶段是从56.5℃开始失重，到97.9℃失重结束，这一阶段主要是βCD失水过程，此后不再失重，第二阶段是从285.1℃开始失重，371.8℃失重结束，这一阶段是βCD的热分解过程，失重率71.6%，此后直到600℃，残留量不在变化； MBC有一个失重过程，从197.5℃开始失重，350.68℃失重结束，失重率为95.5%； βCD与MBC混合物有3个失重阶段，分别是失水阶段、 MBC热分解阶段、 βCD热分解阶段，混合物并没有提高MBC的分解温度； βCDMBC包合物有两个失重阶段，第一个阶段是失水阶段，第二个阶段在261.1℃以前，一直是一个很缓慢的失重过程，总失重率5.3%，这一阶段是受热后，部分MBC缓慢从βCD空腔释放的过程，261.1℃后，βCDMBC包合物开始分解，到383.6℃结束，失重率70.1%， βCDMBC的包合物不同于二者的混合物，又有区别与二者的单体，表明二者生成了新的物相，βCD与MBC形成包合物后，热稳定性明显提高，同样MBC与2HpβCD形成包合物后，在263.4℃开始分解，436.6℃结束，失重率82.3%，MBC与MeβCD形成包合物后，在265.9℃开始分解，到372.2℃结束，失重率62.1% （附录图5，图6，见电子版文后支持信息）。

3.5 XRD分析

由图10A可见，MBC在未被包合之前，呈现松散的颗粒状； 图10B中，环糊精的外表形具有一定的规则，其中βCD呈现立方体，2HpβCD， MeβCD呈现球状； 在图10C中能够看到MBC与环糊精物理混合物各自的形态； 在图10D中，MBC被环糊精包合后，外观形态发生了明显的变化，表明生成了新的物相。

4 结 论

本研究通过溶液法制备了MBC与βCD、 2HpβCD和MeβCD 的包合物。利用一维氢谱、 二维ROESY谱和DOESY技术，建立了一种定性分析疏水性客体分子MBC与环糊精包合物的方法。1H NMR分析表明MBC进入到环糊精的疏水空腔内，受到疏水空腔的影响，MBC质子的化学位移发生变化。2D ROESY证明了包合物的空间构型为苯环靠近环糊精的小口端，咪唑环在环糊精的大口处，烷烃链部分在大口端的外部； DOSY实验中MBC的扩散系数明显下降，说明MBC的表观分子量增大，与环糊精形成了包合物； 红外谱图中MBC特征峰消失或发生变化； X射线粉末衍射中新衍生峰的出现以及扫描电镜揭示的包合物的外貌形态的变化，均表明MBC与3种环糊精之间形成了包合物，热重分析表明MBC与环糊精形成包合物后，MBC的热稳定性明显提高。

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Abstract Hydrophobic medicine carbendazim， come into inclusion compounds with βcyclodextrin （βCD）， 2hydroxypropylβCD （2HpβCD） and 2，6dimethylβCD （MeβCD）， were made by solvent method. By investigating the inclusion behaviors of these three cyclodextrins combined with carbendazim using 1H NMR， 2D rotating frame overhause effect spectroscopy （ROESY） and diffusion ordered spectroscopy， the possible ways of combinations and the recognition ratio of this three inclusion compounds， DβCD=2.516×10 10 m2/s， D2HpβCD=1.676×10 10 m2/s， DMeβCD=2.046×10 10 m2/s， were obtained. According to Xray power diffraction， thermogravimetric analysis， infrared spectroscopy and scanning electron spectroscopy characterization， it was found that the characteristic diffraction peaks changed after carbendazim and cyclodextrin formed into inclusion compounds， and the characteristic diffraction peak of carbendazim at 10.4°， 21.2°， 25.8°， 31.5°（2θ） lost or disappear. The pyrolysis temperature of carbendazim was 197.5℃， and would be higher than 260℃ after it formed inclusion complex. The infrared spectrum also showed that the oscillation peaks of inner cyclodextrin cavum apparently reduced after carbendazim combined， which demonstrated that the position of water molecules inside cyclodextrin cavum were occupied by the carbendazim molecules. With the help of SEM， the appearances of inclusion were different from a single carbendazim molecule， which manifested a new structure appeared.

Keywords Carbendazim； Cyclodextrins； Nuclear magnetic resonance； Inclusion

（Received 13 April 2017； accepted 13 October 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21572177， 21673173， J1210057） and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province， China （Nos. 2015J003， 2016JZ004）.endprint