杞黄颗粒对实验性脉络膜新生血管VEGF蛋白及其mRNA表达的影响*

全 颖 ，梁凤鸣，王 莉 ，王 燕 ，黎红梅，关玉双 ，王莹莹

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193 2.广东省中医院，广东 510000）

脉络膜新生血管（CNV）是湿性老年性黄斑变性（WAMD）区别干性老年性黄斑变性的主要特征，其发生是由于脉络膜的病理性增殖血管突破Bruch膜，长到视网膜色素上皮（RPE）或视网膜神经上皮层下，造成视网膜的渗出、出血甚至瘢痕，导致视力下降、视物变形、视野缺损等[1]。研究显示，VEGF是公认最强的促血管生成因子[2]。抗VEGF药物治疗CNV已成为时下最快速有效的治疗手段之一[3]。而该治疗方式价格昂贵，长效性有待进一步探究，推动研究者去寻找更有效且不良反应小的治疗方案。杞黄颗粒方是梁凤鸣教授总结临床经验而得，治疗黄斑变性取得了确切的疗效，故认为其在治疗CNV方面可发挥功用，改善AMD患者的生活质量。本研究致力于观察杞黄颗粒对BN大鼠VEGF蛋白含量及mRNA表达的影响，探讨杞黄颗粒治疗CNV的效果。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1动物及试剂 BN大鼠81只，雄性，体质量200～250 g（北京维通利华实验动物有限公司）、10%荧光素钠注射液（广州白云山明兴制药有限公司）、若丹明标记的蓖麻子凝集素（Vector公司）、雷珠单抗注射液（Genentech公司）、VEGF抗体（Prteintech公司）等。

1.1.2实验仪器 532 nm倍频Ng：YAG激光机（Quantel·Medical公司）、LV-100激光共焦显微镜（Olympus公司）、光学相干断层扫描（OCT，Heidelberg公司）等。

1.1.3药物 杞黄颗粒（江苏江阴药业公司）由枸杞子、褚实子、茺蔚子、丹参等药物组成。功效：补益肝肾，祛瘀明目等。雷珠单抗注射液（0.2 mL）：Genentech公司。

1.2动物模型的制作 BN大鼠81只，随机分组，13只为空白对照组，68只造模后验证，再分组。将68只大鼠麻醉（1%戊巴比妥腹腔注射，45 mg/kg），右眼散瞳，532 nm激光围绕视盘1.5-2PD光凝，约10个点（功率300 mw，直径 50 μm，曝光 0.05 S）。造模后第7天，68只大鼠中随机选取3只，行OCT、荧光眼底造影（FFA）、激光共聚焦显微镜验证CNV形成。

1.3OCT和FFA检测 随机选取的3只大鼠予OCT、FFA以观察CNV形态及渗漏情况。OCT采用视网膜颞侧后极部和视盘中心连线的直线横向线性扫描，长度2.8 mm，深度2 mm。FFA在腹腔推注10%荧光素钠1 mL/kg，使用海德堡眼底血管造影仪间断拍摄。

1.4激光共焦显微镜检测RPE-脉络膜-巩膜铺片的CNV 随机选取的3只大鼠行OCT、FFA后，行过量麻醉，经心脏灌注400 mL生理盐水和400 mL 4%多聚甲醛，处死，摘除右眼球，固定并洗涤，去除多余组织，RPE-脉络膜-巩膜复合体做6～8个放射状切口，置于TritonX-100中室温24 h。与若丹明标记的蓖麻子凝集素（1∶1 000）室温下避光孵育24 h，洗涤后封片，观察CNV并拍照。

1.5分组及给药方法 造模后第7天，65只大鼠随机分为5组：杞黄A组，给药60天；杞黄B组，给药90 d；雷珠单抗组；杞黄+雷珠组；模型组。每组13只。杞黄A组和杞黄B组和杞黄+雷珠组予杞黄颗粒灌胃，每日1次，药量按照《实验动物学》[4]规定方法折算，不超过2 mL；模型组和空白对照组予生理盐水灌胃，每日1次，用量折算方法同杞黄颗粒；雷珠单抗组和杞黄+雷珠组行右眼玻璃体腔注射雷珠单抗注射液，每次3 μL，每月1次，共3次。

1.6Westen-Blot检测VEGF的蛋白含量 RPE-脉络膜-巩膜复合体用10倍体积的组织裂解液，提取蛋白，电泳，转膜，加入VEGF多克隆抗体，4℃下孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h，应用ECL显色剂显影，Lab Works TM凝胶成像分析系统摄像，分析各条带的亮度值并绘制柱状图。

1.7RT-PCR检测VEGF mRNA表达水平 依据Trizol试剂说明提取总RNA，取2 μL溶解RNA，紫外线光光分度法测定其纯度及浓度后反转录，PCR扩增VEGF，同时扩增β-actin作为内参。应用Primer 5.0软件，设计上下游引物扩增VEGF、βactin的部分CDS区（VEGF-S：5'-CACCACGCTCTT CTGTCTACTGAAC-3'，VEGF-AS：5'-TGCCACAAG CAGGAATGAG-3'，PCR 产物长度应为 117bp；βactin-S：5'-GCTATTTGGCGCTGGACTT-3'，β-actin-AS：5'-GCGGCTCGTAGCTCTTCTC-3'，PCR 产物长度应为78bp），运用SYBR®Premix Ex Taq TM（TaKaRa）进行实时定量PCR反应。数据处理：Folds=2-ΔΔCt。

1.8统计方法 采用SPSS 22.0统计软件包进行统计和分析。除治疗后杞黄颗粒不同时间点VEGF mRNA的比较，选用独立样本t检验外；其余各组治疗之间比较用非参数检验，检验标准α=0.05。

2 结果

2.1OCT和FFA检查结果 OCT图像示：脉络膜不规则增厚，色素上皮下可见团块状或条形或不规则形状的高反射，为CNV（见图1）；激光斑位置视网膜色素上皮层中断，周围呈现环形或不均匀反射信号（见图2）。FFA结果显示：早期可见激光及周边呈现低荧光，部分中期可见点、片状或不规则高荧光，晚期部分渗漏明显，可见片状、盘状或不规则高荧光。大量渗出时伴有大片圆形或不规则遮蔽荧光，边界不清晰，提示有眼底出血（见图3）。

图1 OCT检查结果1

图2 OCT检验结果2

图3 FFA检查结果

2.2共焦结果 造模后铺片可见团簇状或条带状或不规则形状荧光，显示区域多于50%时，则认为CNV（见图 4）。

图4 共焦检查结果

2.3VEGF的蛋白含量的变化 以60 d各组VEGF蛋白含量为检验对象，不符合正态性分布，予非参数检验，结果示：模型组和空白组的VEGF蛋白含量对比明显增多，P＜0.01，具有统计学意义。杞黄A组、雷珠单抗组相比模型组，雷珠单抗组相比杞黄A组，杞黄+雷珠组相比雷珠单抗组，VEGF的蛋白含量均有所降低，但P＞0.05，不具有统计学差异；杞黄+雷珠组相比模型组VEGF的蛋白含量有所降低，P＜0.05，具有统计学差异；杞黄+雷珠组相比杞黄A组VEGF的蛋白含量明显降低，P＜0.05，具有统计学差异，见图5、图6、表1和表2。

以不同时间点两组VEGF蛋白含量为检验对象，不符合正态性分布，予非参数检验，结果示：杞黄B组相比杞黄A组的VEGF蛋白含量有所降低，P＜0.05，具有统计学意义。

2.4VEGF mRNA表达水平的变化 以60 d各组VEGF mRNA为检验对象，不符合正态性分布，予非参数检验，结果示：与空白对照组相比，模型组VEGF mRNA表达水平均明显增加，P＜0.05，具有统计学差异。杞黄A组、雷珠单抗组相比模型组，雷珠单抗组相比杞黄A组，VEGF mRNA有所降低，但P＞0.05，不具有统计学差异。杞黄+雷珠组相比模型组VEGF mRNA有所降低，P＜0.05，具有统计学差异。见表3和表4。

图5 60 d各组RPE-脉络膜-巩膜复合体中VEGF蛋白含量的表达

图6 杞黄A组与杞黄B组VEGF蛋白含量的表达

表1 60 d各组RPE-脉络膜-巩膜复合体中VEGF蛋白含量的表达（±s）

表1 60 d各组RPE-脉络膜-巩膜复合体中VEGF蛋白含量的表达（±s）

注：＃表示两两比较时，与模型组对比具有显著性差异，P＜0.05；*表示两两比较时，与杞黄+雷珠组对比具有显著性差异，P＜0.05。

组别 n 蛋白含量空白对照组 13 552.00±331.98＃模型组 13 1 557.25±493.14杞黄A组 13 1 506.92±516.40*雷珠单抗组 13 1 199.67±393.57杞黄+雷珠组 13 857.25±321.55＃

表2 杞黄A组与杞黄B组VEGF蛋白含量的表达（±s）

表2 杞黄A组与杞黄B组VEGF蛋白含量的表达（±s）

注：*表示与杞黄A组对比具有显著性差异（P＜0.05)。

组别 n 蛋白含量杞黄A组 13 821.83±334.11杞黄B组 13 560.17±288.20*

表360 d各组VEGFmRNA 表达（±s）

表360 d各组VEGFmRNA 表达（±s）

注：*:表示两两比较时，与模型组对比具有显著性差异（P＜0.05）。

组别 n mRNA空白对照组 13 20.12±0.55*模型组 13 18.25±0.80杞黄A组 13 18.77±0.66雷珠单抗组 13 19.19±0.57杞黄+雷珠组 13 19.65±0.58*

表4 杞黄A组与杞黄B组VEGF mRNA表达（±s）

表4 杞黄A组与杞黄B组VEGF mRNA表达（±s）

注：*：表示与杞黄A组对比具有显著性差异（P＜0.05）。

分组 动物数 mRNA杞黄A组 13 32.81±0.13杞黄B组 13 33.46±0.20*

以不同时间点两组VEGF mRNA为检验对象，符合正态性分布，采用独立样本T检验，结果示：杞黄B组相比杞黄A组的VEGF mRNA有所降低，P＜0.05，具有统计学意义。

3 讨论

CNV是诸多眼部疾病的主要病理特征，如WAMD、糖尿病性视网膜病变、息肉样脉络膜视网膜病变、高度近视等疾病[5]。CNV的结构与功能的异常，伴有视网膜的渗出、出血等病变，对视力和视觉造成严重的冲击。有研究认为CNV形成与缺氧、炎症等相关，主要是血管生长因子与血管抑制因子之间的抗衡[6]。VEGF作为主导刺激因子，能够增加血管的渗透性，促进内皮细胞趋化、迁移，降解细胞外基质，为血管形成提供条件，诱导WAMD发病，故国际临床指南多推荐抗VEGF为治疗WAMD的一线治疗[7]。当前抗VEGF的临床研究主要分为2个方面：1）是竞争性结合VEGF受体，阻滞VEGF与其受体结合，抑制VEGF表达，减少CNV形成。如雷珠单抗，是一种人源化单克隆抗体片段，靶向抑制人血管内皮生长因子A与其受体的结合，有效减少VEGF表达，该药治疗经典型或隐匿型WAMD经三期（随机、双盲、对照）临床研究证明，玻璃体腔注射该药可有效提高多数患者的视力，抑制CNV的生成，控制WAMD的进程，并于2013年获得批准，用于治疗CNV致病[8-11]。2）是阻挡VEGF与受体结合后信号通路下游相关激酶的表达，削弱VEGF的作用，如X-82（中国代号CM082），是一种酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制VEGF受体和PDGF受体，阻断CNV的形成，前期应用于抗肿瘤和新生血管。X-82是全球首个治疗WAMD的口服药，2015年其临床试验进入临床IIb期，尚未批准使用[12-14]。综合考虑，雷珠单抗治疗WAMD效果明显且安全性高，认为是当前行之有效的选择。

《灵枢·邪气脏腑病形篇》[15]中认为：十二经脉，三百六十五络，其气血皆上于面而走空窍，其精阳气上走于目而为之睛。《审视瑶函》[16]中则曰：目，内有大络者五，乃心、肝、脾、肺、肾各主一络……通乎血气往来以滋目。眼睛与各脏腑、经络关系密切，气血正常运行得以明视物。近代眼科大家陈达夫先生依据内眼与脏腑经络的关系，提出“中医眼科六经法要之说[17]”，认为视网膜属于足厥阴肝经，而视网膜黄斑区属于足太阴脾经，眼内一切色素属于肾经。WAMD患者多年迈体弱，素体肝血不足，目视不明，肾气不固，瞳神失养，久病致脉络气血亏虚，不能上荣于目，目珠失于涵养。若脾虚失常，津液不能输布，聚湿成痰，痰浊伤于黄斑，气血溢于脉外，脉络瘀阻闭塞，久络伤血，更加影响视物功能，故本病特点为因虚生痰，由虚致瘀，痰瘀互结，虚实夹杂,与肝脾肾紧密相关，治宜从肝脾肾入手,审证求因，区分虚实，健脾滋补肝肾同时祛瘀通络活血。杞黄颗粒经过多年临床证明在治疗干性肝肾阴虚型老年性黄斑变性上有显著疗效[18]，方由枸杞子、褚实子、茺蔚子、丹参等组成。枸杞子入肝肾经，作用为滋补肝肾，养血明目。褚实子入肝肾经，功能为补肾益精，利水消肿。茺蔚子入心包、肝经，功效为养肝明目，活血通经。三者合为君药，既补益肝肾之不足，又能够通经活血以消散脉络之瘀阻，补虚泄实，标本兼顾。

总之，杞黄颗粒经证实治疗干性AMD确有明显的疗效[18-20]，而本实验在其对治疗WAMD的研究中发现，60 d的干预上杞黄颗粒对VEGF的调控作用不明显，但经过90 d的对比后，其呈现出逐步增效的趋势，且与雷珠单抗联合使用时表现出明确下调VEGF表达的效果，治疗WAMD有一定的意义，值得进一步探究。

[1] Fine SL,Berger JW,Maguire MG,et al.Age-related macular degeneration[J].N Engl J Med,2000,34(2):483-492.

[2] Bhutto IA,Mcleod DS,Hasegswa T,et al.Pigment epitheliumderived factor(PEDF)and vascufar endothelial growth factor(VEGF)in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration[J].Exp Eye Res 2006,82(1):99-110.

[3] Sawada T,kakinoki M,wang X,et al.Bimonthly injections of ranibizumab for age-related macular degeneration[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2014,252(10):1545-1551.

[4] 孙瑞元.定量药理学[M].北京：人民卫生出版社,1987.

[5] 唐由之,王慧娟,冯 俊.凉血化瘀方对实验性脉络膜新生血管VEGF与PEDF表达的影响[J].眼科新进展,2009,29(12):881-885.

[6] FolkmanJ.clinicalapplicationsofresearchonangiogenesis[J].N Engl J Med.1995,333(12):1757-1763.

[7] Schmidt-Erfurth U,Chong V,Loewenstein A,et al.Guidelines for the management of neovascular age-related macular degeneration by the European Society of Retina Specialists(EURETINA)[J].Br J Ophthalmol 2014,98(9):1144-1167.

[8] Brown DM,Kaiser PK,Michels M,et al.Ranibizumab versus verteporfim photodynamic therapy for neovascular agerelated macular degeneration:two-year results of the anchor study[J].Ophthalmology 2009:116(1):57-65.

[9]Abraham P,Yue H,Wilson L.Randomized,double-masked,sham-controlled trial of Ranibizumab for neovascular agerelated macular degeneration:PIER study year 1[J].American Journal of Ophthalmology,2010,150(3):315.

[10]Gokcen G,Ali HAkan D,Me HMett AA,et al.Efficacy of aflibercept on exudative age-related macular degeneration in patients exhibiting complete ranibizumab resistance and tachyphylaxis[J].Arq Bras Oftalmol,2016,79(6):384-389.

[11]龚 斌,范传峰,王 玉.抗VEGF药物(雷珠单抗)治疗不同病程湿性年龄相关性黄斑变性62例[J].山东大学耳鼻喉眼学报,2014,28(05):58-61.

[12]Cakmak H,Ergin K,Bozkurt G,et al.The effects of topical everolimns andsunitinib on comeal neovasurization[J].Citan Ocul Toxicol,2015,35(2):1-7.

[13]Kaiser PK.Antivascular endothelial growth factor agents and theirdevelopment:therapeuticimpllicationinoculardisease[J].Am J ophthaimolml,2006,142(4):660-668.

[14]危清泉,任成达,时 慧,等.口服酪氨酸激酶抑制剂CM082对实验大鼠脉络膜新生血管的影响[J].眼科新进展,2016,36(5):414-418.

[15]孙玉信.黄帝内经[M].上海:第二军医大学出版社,2005.

[16]明·傅仁宇.审视瑶函[M].上海:上海人民出版社,1977.

[17]陈达夫.中医眼科六经法要[M].成都:四川人民出版社,1978.

[18]孟 梁,梁凤鸣,王 燕,等.杞黄颗粒对肝肾阴虚型年龄相关性黄斑变性视力及眼底情况的影响[J].辽宁中医杂志,2017,44(02):285-288.

[19]梁凤鸣.年龄相关性黄斑变性的辨证论治探讨[A].中国中西医结合学会眼科专业委员会.第九届全国中西医结合眼科学术交流会暨第八次东北亚国际眼科学术会论文汇编[C].哈尔滨：中国中西医结合学会眼科专业委员会，2010.

[20]王 莉，梁凤鸣，谢晓燕,等.补肾活血法治疗年龄相关性黄斑变性的临床研究[J].长春中医药大学学报,2009,25(3):337-338.