血必净注射液及其药代标示物对脓毒症大鼠炎性因子 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-10表达的影响*

孙梦杰，屠亚茹，欧阳慧子，常艳旭，何 俊

（1.天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300381）

脓毒症是机体出现严重感染时引起的全身性炎症反应[1]，病情严重时可发展为感染性休克、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和多器官功能障碍综合征（MODS）[2]，是重症监护患者最常见的死亡原因，病死率高达 20%～80%[3-4]。

血必净注射液是王今达教授以血府逐瘀汤为基础研制出的中药复方注射液，主要由红花、赤芍、川芎、丹参、当归5种中药组成[5]，含有尿苷、没食子酸、鸟苷、丹参素钠、芍药苷、原儿茶醛、阿魏酸、丹酚酸B、红花黄色素A、洋川芎内酯I、和洋川芎内酯H等有效成分[6]。药理研究表明，血必净具有调控炎症反应、抗氧化应激、改善凝血功能、保护内皮细胞、改善微循环、调节免疫功能等药理作用[7]。目前，血必净注射液已普遍应用于脓毒症及其并发症的治疗,可以明显改善脓毒症患者的症状，减少患者的痛苦[8]。在本课题组之前开展的血必净注射液药代动力学研究中发现，大鼠静脉注射血必净注射液

后，其血浆中羟基红花黄色素A、芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、阿魏酸、迷迭香酸、绿原酸、丹参素9种化合物具有良好的药代动力学属性，最终确定为血必净注射液的药代标示物。研究表明，血必净注射液能降低脓毒症中炎性因子水平[9]，为确定血必净注射液及其药代标示物是否具有相同的药理作用，本实验采用ELISA法分别考察血必净及各给药组对脓毒症大鼠血浆中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和 IL-10的影响。

1 试药与动物

1．1试药 对照品羟基红花黄色素A（MUST-1208 1605）、芍药苷（MUST-16041901）、芍药内酯苷（MUST-15091008）、氧化芍药苷（MUST-15033010）、苯甲酰芍药苷（MUST-15091010）、阿魏酸（MUST-15091605）、迷迭香酸（MUST-16040512）、绿原酸（MUST-15041 814）和丹参素（MUST-15082714）均购自成都曼斯特生物科技有限公司。血必净注射液（1602191）购自天津红日药业股份有限公司。盐酸左氧氟沙星注射液（15101231）购自扬子江药业集团有限公司。生理盐水（6G95G6）购自中国大冢制药有限公司。TNF-α ELISA 检测试剂盒（569m0914）、IL-1 ELISA检测试剂盒（368m0914）、IL-6 ELISA检测试剂盒（385m0914）、IL-8 ELISA 检测试剂盒（386m0914）和IL-10 ELISA检测试剂盒（371m0914）均购自天津安诺瑞康生物技术有限公司。

1.2动物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，级别SPF级，体质量（240±10）g。购自北京华阜康实验动物科技有限公司。

2 方法

2.1药代标示物溶液的配置 精密称取各对照品适量，配置成混合对照品（每毫升含羟基红花黄色素 A 700 μg、芍药苷 1 045 μg、芍药内酯苷 17 μg、氧化芍药苷 44 μg、苯甲酰芍药苷 26 μg、阿魏酸30 μg、迷迭香酸 12.5 μg、绿原酸 4.3 μg、丹参素5.7 μg）。混合对照品中各成分含量与血必净注射液中一致。

2.2动物模型的分组与建立

2.2.1分组 实验大鼠随机分成5组，即空白组、模型组、血必净组、药代标示物组、左氧氟沙星组，每组6只。血必净组及药代标示物的给药剂量均为10 mL/kg左氧氟沙星组的给药剂量为0.83 mL/kg，空白组给予生理盐水（10mL/kg），分别于造模前给药。

2.2.2模型的建立 实验采用盲肠结扎穿孔导致腹腔感染的方法来制备脓毒症大鼠模型。方法如下：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg），待麻醉后沿腹中线切开2.0 cm左右进入腹腔，游离出盲肠，生理盐水浸润后取出，在距盲肠远端1/3处结扎，用9号针头贯通盲肠远端穿刺2次，并挤出少量粪便，回纳，10～0手术缝线逐层缝合伤口。造模后在大鼠皮下注射37℃生理盐水（50 mL/kg）抗休克。

2.3血浆样品的采集 各实验组大鼠在静脉注射给药5 h后，分别于大鼠眼眦静脉取血并置于肝素化塑料管中，用6 000 r/min的转速离心10 min，取上清置于-70℃冰箱储存备用。

2.4ELISA试剂盒检测 将取得的上清液用ELISA法按照检测试剂盒说明书分别检测TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-10的含量。

2.5统计学处理 实验数据用SPSS 18.0软件进行分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用 LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

与生理盐水对照组比较，模型组在造模5 h后炎性因子 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 和 IL-10 显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，血必净组、左氧氟沙星组和药代标示物在给药5 h后，炎性因子TNF-α、IL-1和IL-8有显著降低（P＜0.05），而炎性因子IL-6和IL-10无统计学差异，结果见表1。表明血必净注射液的药代标示物同样能够显著抑制因炎症刺激造成的炎性因子的过度分泌，对治疗脓毒症有很好的疗效。

4 讨论

从西医角度来看，脓毒症的发病原因主要是炎症和凝血功能障碍[10]，机体患脓毒症时，炎症细胞分泌大量的炎性因子导致炎症的发生。西医临床上多用抗生素、营养支持、重症监护治疗等方式进行治疗[11]，但是脓毒症的死亡率仍然很高[12]。为了降低脓毒症的病死率，目前大多采用中西医结合治疗的方法，并且取得了良好的临床效果[13]。从中医角度来看，脓毒症的发病病机为正虚毒损，络脉瘀滞[14]，在外部刺激下，瘀血、毒热、机体正气不足、痰湿内阻，导致经脉运行不畅，脏器损伤[15]。血必净注射液是根据“四证四法”的辨证治疗原则研制出的复方制剂，即:活血化瘀法治疗瘀血；清热解毒法治疗毒热；扶正固本法治疗正气不足；通里攻下法治疗痰湿内阻[16]。临床研究表明，血必净注射液可减少脓毒症患者的病死率，缩短在重症加强护理病房的时间[17-18]。

本实验结果表明，脓毒症模型大鼠静脉注射血必净注射液和其药代标示物5 h后，大鼠血清中IL-1、TNF-α和IL-8水平显著性降低，而IL-6、IL-10的分泌有降低的趋势，但无统计学差异。说明血必净注射液的药代标示物羟基红花黄色素A、芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、阿魏酸、迷迭香酸、绿原酸、丹参素能够显著抑制因炎症刺激造成的细胞因子IL-1、TNF-α和IL-8的过度分泌，且作用相当，为进一步对血必净注射液药效成分的筛选提供了理论基础。

表1 血必净及其药代标示物对脓毒症大鼠血清中炎性因子水平影响 pg/mL

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