六棱菊的薄层鉴别和橙皮苷含量测定研究

魏江存 陈勇 谢臻 秦祖杰 黄冬美 马家宝

摘要：以橙皮苷为指标性成分，建立六棱菊（Laggera alata）薄层鉴别和含量测定方法，比较广西不同产地的六棱菊中橙皮苷含量。薄层色谱中可以检出橙皮苷，斑点清晰，专属性好。橙皮苷进样量在0.30～2.25 μg范围（R2=0.999 6）呈良好的线性关系。六棱菊低、中、高加样组橙皮苷的平均回收率分别为99.60%（RSD=2.78%）、99.97%（RSD=2.08%）和99.01%（RSD=1.36%）。广西境内10批不同产地的六棱菊中橙皮苷的含量差别较大，这可能与气候、温度、土壤、水分、光照等生长条件有关。该方法能有效鉴别六棱菊，准确测定橙皮苷含量，为开发利用六棱菊资源提供了科学依据。

关键词：六棱菊（Laggera alata）;橙皮苷;薄层色谱法;高效液相色谱

中图分类号：S567.23+9         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）23-0139-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.033           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

六棱菊（Laggera alata）系菊科六棱菊属植物，全草入药，性苦、辛，微温，有祛风、除湿、解毒之功效，主要分布于中国东部、东南部至西南部，北至安徽和湖北[1，2]，因其新鲜的枝叶揉搓后散发特殊的臭味，在民间作为抗菌消炎、清热解毒的良药，云南民间称之为“臭灵丹”[3]，以臭灵丹为主的许多复方制剂在临床上应用也取得较好的疗效[4-8]。六棱菊常用于跌打损伤、烧烫伤、毒蛇咬伤、感冒咳嗽、风湿关节炎、皮肤湿疹和腹痛泻痢等多种疾病[3]。目前，临床多用于呼吸道疾病[9]、感冒[10]和病毒感染[11]等疾病的治疗，但其有效成分尚不明确。近年来，国内外学者对六棱菊进行了相关研究，试验表明[3，12-17]，六棱菊主要含黄酮类、倍半萜类和酚酸类等化合物。目前，国内外未见对其进行薄层鉴别和含量测定的相关研究，为保证其药材质量及临床疗效，本试验建立了六棱菊橙皮苷的薄层鉴别和含量测定方法，为建立六棱菊活性成分科学、合理、可控的质量标准提供科学依据。

橙皮苷是极有药用价值的天然资源，研究表明[18，19]，橙皮苷在抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血、血脂调控、抗血栓、降血压及抗心律失常等心血管保护作用方面均有较好的效果，中国拥有丰富的橙皮苷资源，测定六棱菊中橙皮苷的含量，并比较广西不同产地六棱菊中橙皮苷的含量差异，以完善六棱菊的质量控制。

本研究将同时对广西境内10批不同产地的六棱菊进行橙皮苷的薄层鉴别和对其含量测定，为六棱菊药材的质量评价提供参考，也为研究六棱菊药材的质量控制新方法奠定基础。

1  材料与方法

1.1  仪器

2695型高效液相色谱仪（包括2489UV，四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱和Empower3液相工作站），美国Waters公司;Simplicity超纯水系统，密理博中国有限公司;Practum224-1CN分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司;DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司;TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂;HWS-26电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司;尼龙66（Nylon）-22 μm微孔濾膜，天津津腾。

1.2  试药

橙皮苷对照品（批号：170213，纯度>98.0%，上海融禾医药科技有限公司）;甲醇为色谱纯（Fisher， 4 L）;乙醇、磷酸、醋酸和其他试剂为分析纯，试验用水为去离子水。六棱菊药材采摘于广西贺州市昭平县，经广西中医药大学中药鉴定教研室老师鉴定为菊科六棱菊属植物六棱菊的全草。薄层硅胶G板，青岛海洋化工厂。试验所有样品（表1）执行标准均为2015年版《中国药典》一部。

1.3  方法

1.3.1  六棱菊样品制备   采集六棱菊全草，自然晒干后，将其粉碎过三号筛，备用。

1.3.2  薄层鉴别  称取六棱菊药材粉末5 g，加75%乙醇100 mL，回流1 h，滤过，滤液挥干加甲醇3 mL使其溶解，作为六棱菊供试品溶液。取橙皮苷对照品适量，加甲醇溶解，配制成0.32 mg/mL的对照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水体积比为100∶18∶12为展开剂，展开5 cm，取出，晾干，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）的上层溶液作为展开剂，展开12 cm，取出晾干，喷1%的三氯化铝试液，置325 nm紫外光灯下检视。

1.3.3  阴性对照溶液的制备  量取75%乙醇100 mL，回流1 h，滤过，滤液挥干加甲醇3 mL使其溶解，将其作为阴性对照溶液。

1.3.4  对照品溶液制备  精密称取橙皮苷3.75 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得橙皮苷对照品储备液，浓度为0.15 mg/mL。

1.3.5  供试品溶液制备  精密称取六棱菊药材粉末1.0 g，75%乙醇提取，回流，以半径0.65 cm，13 000 r/min离心10 min，取上清液0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.3.6  标准曲线的制备  精密吸取橙皮苷对照品溶液（浓度为150 μg/mL）2、5、8、10、12、15 μL注入液相色谱仪，以峰面积和进样量（μg）分别为纵坐标和横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。

2  结果与分析

2.1  薄层鉴别

薄层鉴别结果检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置处，显相同颜色的斑点，阴性对照色谱在相应位置处无干扰（图1）。

2.2  色谱条件

色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.60 mm× 250 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.5%醋酸（36∶64），检测波长283 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，按照上述条件各组分分离度良好（图2）。

2.3  标准曲线

在“1.3.6”条件下绘制标准曲线为Y=2.0×106X-15 721（R2=0.999 6）。表明橙皮苷进样量在0.30～2.25 μg呈良好的线性关系。

2.4  精密度试验

精密量取对照品溶液适量（150 μg/mL），按“2.2”项的条件连续进样6次，计算橙皮苷峰面积的 RSD为0.23%，小于3%，说明仪器精密度良好。

2.5  稳定性试验

取同一批六棱菊药材粉末1.0 g，按“1.3.5”项下的方法制备供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h后按“2.2”项的条件测定，计算六棱菊峰面积的RSD为2.948%，小于3%，说明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.6  重复性试验

精密称取同一批六棱菊药材粉末1.0 g，精密称定，共6份，按“1.3.5”项下的方法制备成供试品溶液，按“2.2”项的条件测定，计算六棱菊橙皮苷平均含量为0.782 3 mg/g，其RSD为2.86%，小于3%，表明该方法重复性良好。

2.7  加样回收率试验

精密称取同一批已知含量的六棱菊药材粉末（含量为0.782 3 mg/g），共9份，分成3组，即低、中、高加样组（0.5 g药材含量的80%、100%和120%加样，加样量分别为0.312 0、0.391 5、0.469 5 mg），六棱菊低、中、高加样组的橙皮苷的平均回收率分别为99.60%、99.97%、99.01%，RSD分别为2.78%、2.08%、1.36%（n=3），表明该方法准确性良好（表2）。

2.8  样品含量测定

精密称取六棱菊药材粉末（过3号筛）1.0 g，按“1.3.5”项下的方法制备成供试品溶液，采用外标一点法计算橙皮苷的含量，结果见表3。

3  小结与讨论

3.1  流动相的考察

考察了不同甲醇-酸水系统和乙腈-酸水系统（0.05%磷酸、0.1%磷酸、0.2%磷酸、0.5%冰醋酸、0.2%冰醋酸和去离子水），结果表明，甲醇-0.5%冰醋酸溶液作为流动相时，分离度相对较好，基线较平稳，出峰时间适当，故流动相确定为甲醇-0.5%冰醋酸水溶液。

3.2  波长的考察

采用二极管阵列检测器，在200～400 nm波长下对样品和对照品溶液进行全波长扫描，橙皮苷在283和325 nm下有最大吸收。在283和325 nm检测波长时，325 nm基线漂移以及杂峰较多，而用 283 nm时，基线相对平稳，杂峰较少，溶剂峰小，橙皮苷响应值较大，故最终采用283 nm作为本试验的检测波长。

3.3  小结

广西不同产地的六棱菊药材均含有橙皮苷，且橙皮苷含量差异较大，百色田东县所产的六棱菊药材所含橙皮苷含量最高，其次是广西富川县和广西宾阳县，而广西百色靖西市和南宁上林县橙皮苷含量最低。

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