金银忍冬提取物的挥发性成分及抑菌活性分析

2018-03-01高欣妍王海英刘志明段晓玲冯馨慧

生物质化学工程 2018年1期

高欣妍，王海英*，刘志明，段晓玲，冯馨慧

(1. 东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040； 2. 东北林业大学材料科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150040)

金银忍冬(Loniceramaackii(Rupr.) Maxim.)，也称金银木，为忍冬科忍冬属落叶灌木；叶纸质，花芳香；花期为5～6月，果熟期为8～10月；广泛种植于黑龙江、吉林、辽宁的东部，河北、山东东部以及江苏、浙江北部等地区，在朝鲜、日本、苏联远东地区也有分布[1]。金银忍冬常生于林中或林缘溪流附近的灌木丛中，茎皮可制人造棉，花可提取精油，种子榨油可制肥皂。忍冬(LonicerajaponicaThunb.)，也称金银花，藤本，是我国著名的中药材，具有清热解毒、消炎退肿的功效，可用于治疗细菌性痢疾等，其有效化学成分为金银花次生代谢产物绿原酸、异绿原酸[1]。金银忍冬(L.maackii)与忍冬(L.japonica)为同属植物，金银花在现今生活中用量较大，但金银忍冬还处于开发阶段[2-3]，研究者希望通过深入研究金银忍冬，使其能够作为金银花的替代品以减少金银花的使用，因此，近几年金银忍冬逐渐成为研究热点[4-8]。马俊利等[9-10]从金银忍冬叶中分离鉴定出6种化合物，分别为木犀草素、金圣草素、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、绿原酸甲酯和绿原酸。还有研究表明金银忍冬叶和花蕾中均含有绿原酸[11-13]，其花蕾挥发油提取得率为0.2 %，GC-MS分析鉴定出25种成分，占GC含量的80 %以上[14]。但目前关于金银忍冬叶和花中挥发性成分的研究较少，因此，本研究采用索氏提取法，以正己烷为溶剂，分别提取金银忍冬鲜叶和鲜花中的活性物质，通过气相色谱-质谱(GC-MS)法分析其挥发性成分，并通过抑菌活性实验分析其抑菌活性，旨在为金银忍冬的高附加值利用提供基础数据。

1 实验

1.1原料、试剂和仪器

所采植物经鉴定为金银忍冬(Loniceramaackii(Rupr.) Maxim.)，2015年4月于东北林业大学校园采集其鲜叶，2015年5月采集鲜花。正己烷，分析纯；甲醇，色谱纯。大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)均由东北林业大学实验室提供。索氏提取装置，定制；7890A-7000B型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.2提取物的制备

采用索氏提取装置分别提取金银忍冬鲜叶和鲜花，溶剂为正己烷。分别称取金银忍冬鲜叶和鲜花样品各20 g，剪成2～3 cm的小段，分别用滤纸小心包好并用细线扎紧后放入滤筒内，向滤筒内各加入100 mL正己烷溶剂，使样品完全浸没在正己烷中。将滤筒放入水浴锅内，连接好索氏提取装置的各部分，接通冷凝水，于85 ℃水浴加热，索氏提取4 h。采用旋转薄膜蒸发法除去正己烷，分别得到金银忍冬鲜叶和鲜花提取物。称量所得提取物质量，计算得率。

1.3提取物的GC-MS分析

分别将金银忍冬鲜叶和鲜花提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪对试样进行分析。色谱分析条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID检测器；初始温度40 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min的升温速率升到280 ℃并保持2 min；进样口温度250 ℃；进样量1.0 μL；不分流，氦气载气，流速1 mL/min。质谱分析条件：EI电离源，接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描范围为30～500 u。

1.4抑菌活性实验

1.4.1菌悬液的配制将供试大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌种在斜面试管培养基上进行活化，再利用接种环从斜面上轻取少量菌苔，分别添加到盛放有50 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，配制1×106个/mL的菌悬液备用[15]。

1.4.2鲜叶提取物抑菌活性试验金银忍冬鲜叶提取物的稀释(二倍稀释法)：取6支试管，第1支试管中加入0.76 g金银忍冬鲜叶提取物，加入质量分数为50 %的甲醇溶液，定容至2 mL；另取一只干净的空白试管，从第1支试管中抽取1 mL金银忍冬鲜叶提取物-甲醇混合溶液，再加入1 mL 50 %甲醇溶液，轻摇混匀；依次取第3支空白试管，从第2支试管中抽取1 mL金银忍冬鲜叶提取物-甲醇混合溶液加入到第3支空试管中，再加入1 mL 50 %甲醇溶液，轻摇混匀。依此类推直到第6支试管。6支试管中的金银忍冬鲜叶提取物质量浓度分别为0.38、0.19、0.095、0.047 5、0.023 8、0.011 9 g/mL。采用滤纸片法分别测定金银忍冬提取物的抑菌活性。用移液枪吸取已配制好的3种菌悬液各100 μL，均匀涂抹在冷却后的琼脂平板表面，制成含菌平板。取灭菌滤纸片分别放入6种浓度梯度的金银忍冬鲜叶提取物中浸泡1 h，将浸泡过的6 mm圆形滤纸片贴在上述制好的含菌平板上，每个培养皿(直径90 mm)贴上3片浸过同一种质量浓度溶液的滤纸片(滤纸片尽量间隔相同)，以50 %甲醇溶液作为空白对照。把处理过的含菌平板置于37 ℃恒温箱中培养24 h，采用十字交叉法测定菌落直径，按以下公式计算抑制率[16-17]：

抑制率=(处理组抑菌圈直径-空白对照组抑菌圈直径)/处理组抑菌圈直径×100 %

1.4.3鲜花提取物抑菌活性试验金银忍冬鲜花提取物的稀释同样采用二倍稀释法：取0.44 g鲜花提取物，以质量分数为50 %的甲醇溶液为溶剂，得到6支试管质量浓度分别为0.22、0.11、0.055、0.027 5、0.013 8、0.006 9 g/mL的溶液。同样采用滤纸片法分别测定金银忍冬鲜花提取物的抑菌活性，十字交叉法测定菌落直径，其步骤及抑制率计算公式同1.4.2节。

1.4.4数据处理采用Excel2007、SPSS19.0软件进行数据统计分析、处理，数据均以平均值±标准差表示；根据抑制率及相应的提取物浓度，通过SPSS19.0软件计算抑制率为50%时的半数抑制浓度(IC50)。

2 结果与分析

2.1提取物的挥发性成分分析

2.1.1鲜叶提取物的GC-MS分析采用索氏提取法以正己烷为溶剂提取得到的金银忍冬鲜叶提取物为淡黄色透明液体，得率为0.95 %。提取物样品的总离子流色谱图如图1所示，总GC含量92.87 %的化合物被鉴定，共鉴定出34种化合物，通过面积归一化法计算出各组分的GC含量，结果如表1所示。

图 1 金银忍冬鲜叶提取物的总离子流色谱图

从表1可知，金银忍冬鲜叶提取物主要由醇类(31.66 %)、烷烃类(11.88 %)、酯类(10.52 %)、酮类(9.47 %)、滨蒿内酯(8.16 %)、醛类(6.40 %)、烯烃类(5.54 %)、异长叶醇甲醚(2.97 %)、D-荷包牡丹碱(1.52 %)、芳烃类(1.06 %)、酚类(1.02 %)、斑蝥素(1.00 %)、菊酯(0.99 %)、木防己苦毒素(0.68 %)组成。GC含量最高的化合物是(-)-异长叶醇(22.63 %)，其次是2,7,10-三甲基-十二烷(10.48 %)。

表 1 金银忍冬鲜叶提取物的GC-MS分析Table 1 GC-MS analysis of fresh leaves extracts of L. maackii

续表1

序号No．保留时间/minretentiontime化合物名称compoundname分子式 molecularformul GC含量/%GCcontent匹配度/%matchingdegree128．948苯乙醛benzeneacetaldehydeC8H8O0．3871．68139．3125⁃(1⁃甲基⁃丙基)⁃壬烷5⁃(1⁃methyl⁃propyl)⁃nonaneC13H280．1261．52149．7762，7，10⁃三甲基⁃十二烷2，7，10⁃trimethyl⁃dodecaneC15H3210．4871．001510．1701，2，3，4⁃四甲基⁃苯1，2，3，4⁃tetramethyl⁃benzeneC10H140．1380．831611．197萘naphthaleneC10H80．3482．991711．3152⁃(1⁃甲基⁃乙基)⁃环己醇2⁃(1⁃methyl⁃ethyl)⁃cyclohexanolC9H18O0．2963．481811．373斑蝥素cantharidinC10H12O41．0062．561913．4013，7⁃二甲基⁃2，6⁃壬二烯⁃1⁃醇3，7⁃dimethyl⁃2，6⁃nonadien⁃1⁃olC11H20O0．1868．302013．618(6⁃羟基⁃甲基⁃2，3⁃二甲基⁃苯基)⁃甲醇(6⁃hydroxy⁃methyl⁃2，3⁃dimethyl⁃phenyl)⁃methanolC10H14O20．1877．552113．7623，5⁃二甲基⁃苯甲酸甲酯3，5⁃dimethyl⁃benzoicacidmethylesterC10H12O20．1775．372215．5503，5⁃二(1，1⁃二甲基⁃乙基)⁃苯酚3，5⁃bis(1，1⁃dimethyl⁃ethyl)⁃phenolC14H22O1．0289．272316．2423⁃(2，6，6⁃三甲基⁃1⁃环己烯基)⁃2⁃丙烯⁃1⁃醇3⁃(2，6，6⁃trimethyl⁃1⁃cyclohexenyl)⁃2⁃propen⁃1⁃olC12H20O1．8076．352417．1512，3⁃二氢⁃4，4⁃二甲基⁃吲哚⁃4⁃醇⁃2⁃酮2，3⁃dihydro⁃4，4⁃dimethyl⁃indole⁃4⁃ol⁃2⁃oneC10H11NO26．2676．132517．280(-)⁃异长叶醇甲醚(-)⁃isolongifololmethyletherC16H28O2．9767．262617．409(-)⁃异长叶醇(-)⁃isolongifololC15H26O22．6365．342717．4972⁃羟基⁃4，4，8⁃三甲基⁃三环[6．3．1．0(1，5)]十二烷基⁃9⁃酮2⁃hydroxy⁃4，4，8⁃trimethyl⁃tricyclo[6．3．1．0(1，5)]dodecan⁃9⁃oneC15H24O23．2169．532817．5495，9，9⁃三甲基⁃5⁃磷杂⁃三环[6．1．1．0(2，6)]⁃2(6)⁃癸烯5，9，9⁃trimethyl⁃5⁃phospha⁃tricyclo[6．1．1．0(2，6)]⁃2(6)⁃deceneC12H19P3．1071．642917．681炔咪菊酯imiprothrinC17H22N2O40．9966．423017．954D⁃荷包牡丹碱D⁃bicucullineC20H17NO61．5265．743118．072滨蒿内酯scoparoneC11H10O48．1668．153218．701木防己苦毒素picrotoxinC30H34O130．6867．513319．4372，4，7，14⁃四甲基⁃4⁃乙烯基⁃三环[5．4．3．0(1，8)]十四烷基⁃6⁃醇2，4，7，14⁃tetramethyl⁃4⁃vinyl⁃tricyclo[5．4．3．0(1，8)]tetrade⁃can⁃6⁃olC20H34O2．0168．473420．512邻苯二甲酸二丁酯dibutylphthalateC16H22O41．1064．57

2.1.2鲜花提取物的GC-MS分析采用索氏提取法以正己烷为溶剂提取得到的金银忍冬鲜花提取物为淡黄色透明液体，得率为0.83 %。提取物样品的总离子流色谱图如图2所示。总GC含量70.94 %的化合物被鉴定，共鉴定出30种化合物，通过面积归一化法计算出各组分的GC含量，结果如表2所示。

从表2可知，金银忍冬鲜花提取物主要由酯类(31.33 %)、烷烃类(20.79 %)、酸类(4.93 %)、醇类(4.57 %)、酚类(2.89 %)、醛类(2.82 %)、芳烃类(1.64 %)、酮类(1.61 %)、trans-芳樟醇氧化物(呋喃型化合物)(0.27 %)、香草乳糖苷(0.09 %)组成。GC含量最高的化合物是2,7,10-三甲基-十二烷(14.16 %)，其次是邻苯二甲酸二丁酯(9.60 %)。

表 2 金银忍冬鲜花提取物的GC-MS分析

2.2抑菌活性分析

2.2.1鲜叶提取物的抑菌活性分析空白对照组无抑菌效果，金银忍冬鲜叶提取物的抑菌活性如表3所示。从表3可以看出，金银忍冬鲜叶提取物在低质量浓度0.011 9 g/mL时对3种供试菌种仍有抑制作用。质量浓度为0.19 g/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径达到13.81±1.48 mm，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑制效果较为显著。半数抑制浓度(IC50)越小，表示样品的抑菌活性越高，金银忍冬鲜叶提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的IC50分别为0.039和0.099 g/mL，对金黄色葡萄球菌的IC50<0.011 9 g/mL。可以看出，金银忍冬鲜叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑制活性最强，对3种细菌的抑制活性的顺序为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌。

表 3 金银忍冬鲜叶提取物的抑菌活性

1)同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同行不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，下同 different lowercase letters in the same column indicated significant difference(P<0.05),and different capital letters in the same line indicated significant difference(P<0.05),similarly hereinafter

2.2.2鲜花提取物的抑菌活性分析空白对照组无抑菌效果，金银忍冬鲜花提取物的抑菌活性如表4所示。从表4可以看出，金银忍冬鲜花提取物在质量浓度0.027 5～0.22 g/mL范围内，对大肠杆菌有较好的抑制作用。对金黄色葡萄球菌抑菌效果最显著，IC50值最小，为0.053 g/mL；对大肠杆菌的IC50值为0.069 g/mL，对枯草芽孢杆菌的IC50值为0.144 g/mL。金银忍冬鲜花提取物对3种细菌抑制活性顺序为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌。

表 4 金银忍冬鲜花提取物的抑菌活性

2.2.3金银忍冬提取物的抑菌活性比较壳聚糖具有抑菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径均大于11 mm[18]。壳聚糖-银纳米微粒(CS-Ag NPs)表面修饰前后的木纤维对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、蜡状芽庖杆菌以及革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌的抑菌率都在 99.0 %以上[19]。飞龙掌血提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径均大于11 mm[20]。高艳清[21]研究结果表明β-蒎烯衍生物样品对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为8 mg/L，与对照品新洁尔灭效果相当。降解黑荆树栲胶对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为0.05 %、0.03 %、0.03 %[22]。由以上分析可知，金银忍冬鲜叶及其鲜花提取物的抑菌活性较壳聚糖、壳聚糖-银纳米微粒、飞龙掌血提取物、β-蒎烯衍生物、降解黑荆树栲胶的抑菌活性弱。金银忍冬鲜叶及其鲜花提取物的抑菌活性有待进一步研究。

3 结论

3.1以正己烷为溶剂，采用索氏提取法，分别提取金银忍冬鲜叶和鲜花中的活性物质，并通过气相色谱-质谱(GC-MS)法分析其挥发性化学成分。分析结果表明：金银忍冬鲜叶提取物中总GC含量92.87 %的化合物被鉴定，共鉴定出34种化合物；GC含量最高的化合物是(-)-异长叶醇(22.63 %)，其次是2,7,10-三甲基-十二烷(10.48 %)。金银忍冬鲜花提取物中总GC含量70.94 %的化合物被鉴定，共鉴定出30种化合物；其中GC含量最高的化合物是2,7,10-三甲基-十二烷(14.16 %)，其次是邻苯二甲酸二丁酯(9.60 %)。

3.2抑菌活性分析结果表明：金银忍冬鲜叶提取物在低质量浓度0.011 9 g/mL时对3种供试菌种均有抑制作用。提取物质量浓度为0.19 g/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径达到13.81±1.48 mm；对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑制效果较为显著，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的IC50分别为0.039和0.099 g/mL，对金黄色葡萄球菌的IC50<0.011 9 g/mL，因此，金银忍冬鲜叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑制活性最强；对3种细菌抑制活性顺序为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌。金银忍冬鲜花提取物在质量浓度0.027 5～0.22 g/mL范围内，对大肠杆菌有较好的抑制作用，对金黄色葡萄球菌抑菌效果最显著，IC50值最小，为0.053 g/mL；对大肠杆菌的IC50值为0.069 g/mL，对枯草芽孢杆菌的IC50值为0.144 g/mL；对3种细菌抑制活性顺序为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌。

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