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清洁级獭兔在猪瘟活疫苗质量检定中的敏感性研究

2018-03-01潘晶晶吴润生高昔英陈国兰郑忠东郑立锋陈先进詹先强翁顺太

福建畜牧兽医 2018年1期
关键词:獭兔白兔猪瘟

潘晶晶 吴润生 高昔英 陈国兰 郑忠东 郑立锋 陈先进 詹先强 翁顺太*

(1.福州大北农生物技术有限公司 福州 350014;2.福建省人兽共患病研究重点实验室 福建省疾病预防控制中心 福州 350001)

兔热原检查法是猪瘟活疫苗效价测定最经典、最有效的方法之一,也是《中华人民共和国兽药典》收录的法定检测方法。影响兔热原检查的因素除了饲养环境、试验环境及试验控制技术外,兔的品种、来源、日龄、体质量及微生物控制等级等对热原检查结果也有很大影响。本研究选取清洁级日本大耳白兔、普通级日本大耳白兔、清洁级獭兔、非等级獭兔、非等级福建黄兔等进行对比试验,目的是为了筛选出对猪瘟病毒更敏感、热原反应更稳定的兔品种,观察不同微生物控制等级的试验兔对猪瘟病毒的敏感性差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用兔及设施 清洁级獭兔由本课题组自行培育提供,生产许可证 SCXK(闽)2016-0001;清洁级日本大耳白兔由青岛康大生物科技有限公司提供,生产许可证 SCXK(鲁)2015-0003;普通级日本大耳白兔由福建省连江玉华山自然生态农业试验场提供,生产许可证SCXK(闽)2014-0001;福建黄兔由福州某黄兔养殖场提供,所有试验用兔外观无异常;非等级獭兔由浙江某獭兔养殖场提供,所有试验用兔外观无异常。以上试验兔体质量为1.5~3.0 kg,日龄为80~110日龄,性别不限。实验室使用许可证号为 SYXK(闽)2016-0002。

1.1.2 供试样品 批次1:猪瘟活疫苗(兔源),由福州大北农生物技术有限公司生产,批号为2017011。批次2:猪瘟活疫苗工作抗原,由福州大北农生物技术有限公司生产,批号为2016001。

1.1.3 试验器具 2 mL注射器、20 mL试管、10 mL移液管、1 mL移液管、灭菌生理盐水、试验兔固定架、水银体温计。

1.2 试验方法

1.2.1 试验前准备

1.2.1 分组 分别设立清洁级日本大耳白兔、清洁级獭兔、普通级日本大耳白兔、非等级獭兔、非等级福建黄兔等5个组别,每组各72只。

1.2.2 正常体温检测 试验兔于正式试验开始前2 d进行正常体温的测量,每日选择10:00和16:00两个时间段测温,共测量5个温次。选取5个温次的温差不超过0.5℃的试验兔进行试验,5次体温的平均值作为试验兔的基础体温。测温时将兔仰卧放置于特定的固定架中,体温计水银球置入肛门内3~4 cm,3 min后读取并记录。

1.2.3 稀释接种 将供试样品用灭菌生理盐水稀释成不同稀释度,通过耳缘静脉接种不同试验兔,剂量为每只1.0 mL。接种后,上午、下午各测体温1次。48 h后,每隔6 h测体温1次,根据体温变化曲线进行综合判定。先利用少量动物(2~4只/批次)进行敏感性排查,一旦确定终点反应后再进行较大量动物(20 只/批次)试验。

1.2.4 结果判定 接种供试样品后,兔的体温反应有以下四种。具体判定标准参照《中华人民共和国兽药典》[1]。

1.2.4.1 定型热反应(++) 潜伏期48~96 h,体温上升呈明显曲线,至少有3个温次升高1℃以上,并稽留 18~36 h。

1.2.4.2 轻热反应(+) 潜伏期48~96 h,体温上升呈明显曲线,至少有2个温次升高0.5℃以上,并稽留 12~36 h。

1.2.4.3 可疑反应(±) 潜伏期48~96 h,体温曲线起伏不定,稽留不到12 h;或潜伏期在24 h以上,不足48 h及超过96 h至120 h出现热反应。1.2.4.4 无反应(-) 体温正常。

1.3 数据分析 应用SPSS17.0统计处理软件进行单因素方差分析和LSD多重比较。

2 结 果

1)将两批供试样品均稀释成1:750头份/mL、1:900头份/mL、1:1 050头份/mL等三个稀释度,各接种 2只 80~90 d、2.0~2.25 kg试验兔。检测结果见表1-表 2。

表1 批次1检测结果

表2 批次2检测结果

2)从表1和表2可以看出,批次1和批次2的检测结果大同小异。因此,接下来4个阶段只进行批次2的检验。提高样品的稀释度,将批次2供试样品稀 释 成 1:1 350 头 份/mL、1:1 650 头 份 /mL、1:1 950头份/mL等三个稀释度,各接种100~110 d、2.25~2.5 kg试验兔。检测结果见表3。

表3 批次2第二阶段检测结果

3)继续提高样品稀释度,将批次2供试样品稀释成1:2 800头份/mL、1:3 000头份/mL、1:3 200头份/mL等三个稀释度,各接种2只80~85 d、1.75~2.0 kg试验兔。检测结果见表4。

表4 批次2第三阶段检测结果

4)进一步提高稀释度并加大样本数量,将批次2供试样品稀释成1:3 400头份/mL、1:3 600头份/mL 等两个稀释度,各接种 4只 85~90 d、2.0~2.25 kg试验兔。检测结果见表5。

表5 批次2第四阶段检测结果

5)临近终点,再次提高稀释度并加大样本数量,将批次1、批次2供试样品分别稀释成1:3 800头份/mL, 各接种 20只 85~90 d、2.0~2.25 kg试验兔。检测结果见表6-表7;各组别体温变化曲线(随机选取批次2的10只试验兔)见图1-图5。

表6 批次1第五阶段检测结果

3 讨论与小结

3.1 试验过程设计与条件摸索 刚开始试验阶段,为找到试验兔接近反应终点的样品稀释度,结合动物的日龄与体质量,不断从低稀释度到高稀释度进行检测,此时的动物就像试金石。从试验第一阶段到第四阶段,全部试验兔均由本课题组自繁自育,没有免疫接种,也不存在运输应激,完全依托科学化管理来提高动物质量。从试验结果可以看出,由于动物质量的提升,体温变化的差异并不明显。

表7 批次2第五阶段检测结果

图1 批次2清洁级日本大耳白兔(1∶3 800)

图2 批次2清洁级獭兔(1∶3 800)

图3 批次2普通级日本大耳白兔(1∶3 800)

图4 批次2非等级獭兔(1∶3 800)

3.2 低稀释度下各组试验兔对猪瘟病毒的敏感性比较 对五组试验兔分别接种不同稀释度的猪瘟病毒后的热原反应进行对比,应用SPSS17.0统计处理软件进行检验,结果差异并不显著(P>0.05)。由此可见,在1:750、1:900、1:1 050稀释度时几个品种兔的敏感性差异并不显著,从表1-表3可以看出,在低稀释度时五组试验兔均有较好的热原反应,反应率无明显差异。将稀释度提高至1:1 350、1:1 650、1:1 950时,清洁级日本大耳白兔、清洁级獭兔和非等级獭兔略优于普通级大耳白兔和非等级福建黄兔,但差异仍不明显。这可能与低稀释度下,病毒效价比较高,对动物的敏感性同样较高有关。

3.3 高稀释度下各组试验兔对猪瘟病毒的敏感性比较 高稀释度时,同样的环境条件、相近的日龄与体重(80~110 d、1.75~2.5 kg),五组试验兔的反应率开始体现出较大的差异,应用SPSS17.0统计处理软件进行检验,比较差异具有统计学意义(P<0.05)。从表 4 可以看出,1:2 800、1:3 000、1:3 200 三个稀释度,清洁级试验兔的反应情况明显优于普通级或非等级试验兔;从表5可以看出,1:3 400稀释度,清洁级獭兔、清洁级日本大耳白兔及非等级獭兔的定型热反应率均为100%,普通级日本大耳白兔的定型热反应率为80%,非等级福建黄兔的定型热反应率为50%。在1:3 600稀释度时,清洁级獭兔的定型热反应率为 100%(其中以 85~90 d、2.0~2.25 kg的獭兔反应为最佳),清洁级日本大耳白兔与非等级獭兔的定型热反应均为80%,普通级日本大耳白兔和非等级福建黄兔的定型热反应率均为50%。从表6-表7可以看出,1:3 800稀释度时,清洁级獭兔的定型热反应率为95%,清洁级日本大耳白兔的定型热反

应率为77.5%,非等级獭兔的定型热反应率为75%,普通级日本大耳白兔的定型热反应率为27.5%,非等级福建黄兔的定型热反应率为50%。从图1-图5的体温变化曲线可以看出,清洁级獭兔的体温变化曲线更为稳定,接种后的升温时间点、升温持续时间、体温曲线变化最为接近,同一稀释度下对猪瘟病毒的敏感性无明显个体差异。高反应率及稳定的体温曲线变化,清洁级獭兔成为猪瘟活疫苗质量检定首选目标性等级试验兔。

3.4 引起敏感性差异的原因

3.4.1 品种间的敏感性差异 日本大耳白兔、獭兔、福建黄兔三个品种兔对猪瘟病毒均有较高的敏感性,特别在低稀释度时的热型反应都非常稳定,随着稀释度的不断升高,三个品种兔对猪瘟病毒的敏感性差异也逐渐体现,其中清洁级獭兔在反应率与体温变化曲线方面均明显优于其他品种兔,可见经过净化培育的獭兔用于猪瘟病毒热原检查,其敏感性显著高于其他品种兔。这一结果与詹先强等[2]研究结果一致。符合实验动物国家质量标准的等级獭兔更有优势、更有保障。

3.4.2 饲养管理差异引起的敏感性差异 在高稀释度对比时,清洁级试验兔的反应情况明显优于普通级的试验兔,二者之间最大的差异体现在饲养管理方面。清洁级试验兔生产管理更为规范,动物种群维持较好,寄生虫和微生物控制水平也更为严格,而普通级试验兔属于开放饲养,卫生管理制度不规范、不严格,饲养环境简易、开放,饲养设施湿度、通风换气等指标不理想,存在采用自制或无生产许可证企业生产的饲料、繁殖种群小或直接从农户收购、滥用抗生素和药物等问题,这些因素是导致家兔品质不稳定的主要原因[3]。普通级日本大耳白兔早已入选国家实验动物名录,质量上可以满足检验要求。前四阶段所使用非等级獭兔一直自繁自育,质量理应可以保证,即使是第五阶段外购的非等级獭兔,其反应也比非等级福建黄兔好,这可能与培育过程和经济利益有关系,皮用獭兔注重皮张质量,如果日常管理不到位,势必造成獭兔质量差从而降低皮张等级,影响经济利益。

3.4.3 日龄与体重的影响 不同来源、不同品种的试验兔,由于品种间差异、管理水平差异,往往造成动物日龄记录不准确、体质量参差不齐,最终影响检测结果。即使是同样环境条件、同样营养水平、相近日龄、同样的免疫程序,也可能造成体质量的差异,如日本大耳白兔的增重效果比獭兔和福建黄兔要好。实践中到底是以试验兔的体质量为选择指标还是以日龄来衡量?在《中华人民共和国兽药典》中仅规定体重1.5~3.0 kg的试验兔,对日龄并未作出规定,该范围选择过于宽泛。笔者认为应该以动物的日龄为衡量指标,辅以界定动物的体质量,这样才能反映出动物的正常生理发育状况。

笔者在长期从事兽用疫苗质量检定工作中,摸索出最能接近疫苗正常反应的动物日龄与体质量的大致标准,即 105~110 d、2.25~3.0 kg 的兔源反应率最高。本试验结果提示 85~90 d、2.0~2.25 kg的獭兔在高稀释度时反应率最好,这无形中就降低了试验獭兔的利用日龄与体质量,也降低动物的饲养周期,进而降低动物的饲养成本和管理成本。

3.4.4 应激引起的敏感性差异 家兔机敏,易受惊,对环境条件变化的反应特别敏感。在运输过程中拥挤、长途颠簸,试验兔难免存在生理应激、心理应激、气候应激、饥渴应激,加上饲养环境条件改变造成的应激等,都是造成敏感性差异的影响因素。由于试验兔对体温变化非常敏感,最易产生发热反应,因此,为保证检验的准确性,首先运输车辆应能满足运输动物的基本福利要求,其次在购入试验兔后要酌情延长检疫观察的周期,加强饲养管理,待试验兔适应新环境、体温趋于稳定后才能进行相关试验[4-6]。

3.4.5 免疫应答引起的敏感性差异 经济动物是允许进行计划免疫的,如兔出血热病毒、狂犬病病毒、犬瘟热病毒等。而从实验动物角度,除普通级动物外,其他等级动物是不允许进行免疫接种的。五组试验兔中,虽然普通级日本大耳白兔和非等级獭兔可以免疫,但前四阶段均采取自繁自育的繁殖模式,管理措施相对科学规范,没有进行任何免疫接种,故敏感性检测差异并不大 (当然与供试样品的稀释度低有很大关系)。第五阶段,除清洁级獭兔和日本大耳白兔仍采取自繁自育外,其他兔源全部外购,敏感性试验的差异性即显现出来。固有的免疫接种是否会与其他试验产生协同或拮抗作用,机制尚不明确,有待相关试验予以佐证。

3.4.6 隐性感染引起的敏感性差异 有许多动物疫病是以隐性感染存在的,临床上并不表现出症状。一旦受长途运输应激、试验干扰、免疫刺激等因素影响,症状就可能显现,如鼠肝炎病毒、泰泽氏菌等。病毒、细菌、真菌或寄生虫感染都能从多方面改变动物机体的生理功能,这种改变无疑将影响到动物的免疫系统。病毒感染引起的免疫抑制表现为干扰正常免疫系统的功能、改变抗原的吸收和处理、破坏抗体形成细胞和浆细胞(如白血病病毒)[7]。第五阶段,外购的试验兔是否携带隐性感染疫病,在试验处置条件下影响试验结果,尚需进一步考证。

[1]中国兽药典委员会.《中华人民共和国兽药典》2015年版三部CVP3/2015/HYM/039:103-104.

[2]詹先强,姚尧,翁顺太,等.不同品种兔对猪瘟兔化弱毒疫苗敏感性的研究[J].医学动物防制,2017,33(3):304-306.

[3]范文平,张潇,贺争鸣,等.生物制品热原实验用家兔胃肠道疾病的原因探讨和相应对策[J].中国药事,2012,26(8):834-837.

[4]胡艳,郭礼荣,邓勇波,等.应激对普通级实验兔生产的影响及其防控[J].中国养兔,2009(5):31-33.

[5]曾彦钦,吴润生,林志坤,等.酷暑对兔体温和猪瘟定型热比率的影响[J].福建农业学报,2007,22(3):283-287.

[6]王慧,符欣蕙.探讨热原试验中影响试验数据的因素[J].微生物学免疫学进展,2016,44(1):32-34.

[7]孙以方.医学实验动物学[M].兰州:兰州大学出版社,2005.

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