某规模化猪场猪蓝耳病的诊断控制及其病原分子学研究

陈 雷

福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高度接触性传染病，又称猪蓝耳病[1]。该病以繁殖障碍、呼吸道疾病、免疫抑制和持续性感染等为主要特征，其临床症状主要表现为妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各阶段猪的呼吸道症状[2-3]。该病于1987年首先在美国发现，随后于1988年和1990年在加拿大和德国发生。1991年在荷兰暴发PRRS，并迅速蔓延。中国台湾于1991年发现该病，中国大陆于1996年发现该病，并成功分离到北美型毒株，2006年初，我国南方猪群中暴发以发病急、传播快、高发病率和病死率等为特征的高致病性蓝耳病，给我国养猪业带来了难以估量的损失[4]。2015年又出现新型变异株[5]。目前，PRRS在世界范围内流行，给各国养猪业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了国际间生猪及其猪产品的贸易，已成为威胁全球养猪业健康发展的主要疫病之一。

目前疫苗免疫仍然是该病的主要防控手段，但不同厂家的疫苗其免疫结果大相径庭，笔者根据浙江某规模化猪场猪群生产成绩、猪蓝耳病的发病情况，并结合实验室检测结果及毒株的分子生物学信息，探讨当前该猪场猪蓝耳病的流行特点及疫苗免疫与流行株之间保护力的关系，以期为猪蓝耳病的有效防控提供临床指导。

1 材料方法

1.1 猪场选择及猪场背景 蓝定抗使用5年生产成绩稳定的规模化猪场为浙江金华市某猪场，存栏母猪480头，2012年使用福州大北农生物技术有限公司蓝定抗至今，生产成绩较为稳定。其中2015年猪场暴发流行性腹泻，损失仔猪近487头。

该场的免疫疫苗有：猪瘟疫苗、伪狂犬疫苗、圆环疫苗、支原体疫苗、口蹄疫疫苗和蓝耳疫苗。猪场的生产成绩如下（见表1）。

1.2 试验材料 解剖亚健康保育猪4头，采集脾脏、淋巴结、肺脏和其他病变组织，并送实验室检测。

1.3 试验方法 以提取的样品cDNA为模板，利用聚合酶链式反应方法（RT-PCR）对猪蓝耳病病毒进行扩增。根据GenBank中GP5基因片段，在其保守区设计特异性引物对阳性样品进行RT-PCR扩增，扩增产物送至上海立菲生物技术有限公司进行测序。

表1 猪场2011-2016年生产成绩

1.4 GP5基因生物信息学分析 用DNAstar软件对阳性样品GP5基因进行核苷酸同源性分析，通过MEGA6.0构建进化树，分析其遗传进化关系。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测结果 检测结果显示：送检的4份病料中有3份为阳性。对阳性样品 （暂命名为ZJ-01株）进行GP5基因扩增，扩增出大小约600 bp的目的条带（见图1）。

2.2 GP5基因生物信息学分析 遗传进化分析发现，构建的进化树分为两大基因型：GenotypeⅠ,GenotypeⅡ。GenotypeⅡ分为5个亚群：以VR2332为代表株的Ⅰ亚群；以CH-1a为代表株的Ⅱ亚群；以HP-PRRSV为代表的Ⅲ亚群；以NADC30为代表株的Ⅳ亚群；以GM2重组株为代表株的Ⅴ亚群。ZJ-01株与ZJ1503株亲缘关系较近，核苷酸同源性达93.7%；与QYYZ株、CM2株属于同一进化分支，亲缘关系较近，同位于Ⅴ亚群（见图2-图3）。

图1 GP5基因RT-PCR检测结果

3 讨 论

1）GP5基因核苷酸同源性分析发现，ZJ-01株与ZJ1503株亲缘关系较近，同源性达93.7%。遗传进化分析发现，该流行株与QYYZ株、CM2株属于同一进化分支，亲缘关系较近。其中QYYZ株、CM2株同来源于中国流行株与进口的经典疫苗株MLV的重组株。此外，该毒株与类NADC30株、经典株、变异株的核苷酸同源性均不是很高，达85%左右，推测该毒株极有可能是经典株与流行株的新重组株。

图2 ZJ-01株GP5基因核苷酸同源性分析

图3 ZJ-01株GP5基因遗传进化分析

2）这一结论与中国农业科学院报道出现的猪蓝耳病病毒的自然重组毒株结果相符合。2006年起，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物病原监测与分子流行病学创新团队对我国猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病学开展了持续大量的监测工作，发现了输入性的北美毒株与本地流行株发生自然重组现象。2015年，Zhao等[4]报道了具有高致病性的毒株JL580，指出该毒株为NADC30与Hp-PRRSV的重组株。Li等[6]报道了HNyc15为VR2332与CH-1a的重组病毒株。张洪亮等[7]对15株类NADC30株PRRSV进行重组分析发现，除LNCH160407株外，其余14株均存在重组现象。PRRSV的重组现象已经成为大家关注的焦点之一，探讨PRRSV重组株的有效防控方案迫在眉睫。

3）通过对猪场2011年保育猪成活率只有50%、免疫蓝定抗后猪群处于稳定状态、临床使用效果以及对ZJ-01株GP5基因的生物信息学分析，推测猪场自然重组毒株（ZJ-01株）的致病性既没有高致病性蓝耳病那样有很大的危害，也没经典毒株那么温和，其致病性介于两者之间，所以，一定要引起足够重视。免疫蓝定抗弱毒活疫苗后，该猪场一直很稳定，由此说明蓝定抗对该自然重组毒株有很好的交叉免疫保护。

[1]Park C H,Hwi W S,Kang Ikjae,et al.A new modified live porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine improvesgrowth performance in pigsunder filed conditions[J].Clinical and Vaccine immunology,2014,21(9):1350-1356.

[2]郭宝清,陈章水,刘文兴,等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病,1996,18(2):1-4.

[3]Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRSin China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS One,2007,2(6):e526.

[4]Zhao K,Ye C,Chang X B,et al.Importation and recombination are responsible for the latest emergence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virusin China[J].JVirol,2015,89(20):10712-10716.

[5]高志强,郭鑫,杨汉春,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒缺失变异株的基因组特征[J].畜牧兽医学报,2005,36(6):578-584.

[6]Li Y Y,Ji G B,Wang J,et al.Complete genome sequence of an NADC30-Like porcine reproductive and respiratory syndrome virus characterized by recombination with other strains[J].Genome Announc,2016,4(3):330-336.

[7]张洪亮,张晶,李真,等.2016年我国部分地区类NADC30新亚群猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析 [J].中国预防兽医学报,2016,38(9):676-680.