天麻钩藤饮对帕金森病模型大鼠行为学及纹状体内多巴胺含量的影响

张立娟 张 倩 王康锋 李思毅 杨 洁 王庆庆 彭 伟

（1.山东中医药大学附属医院，山东济南250014； 2.陕西中医药大学针灸推拿学院，陕西西安710000）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD），又称震颤麻痹，是一种严重危害老年人健康的神经退行性疾病，主要临床表现有静止性震颤、肌强直、运动迟缓及自主神经症状等。该病多见于中老年人，在年龄大于65岁的人群中发病率大约为1%～3%，仅次于阿尔茨海默病[1]。据统计，我国目前PD患者已经超过百万，预计到2030年我国PD患者人数将达到500万[2]，这必然给家庭和社会带来沉重负担。遗憾的是，PD的发病机制仍未完全阐明，目前依然没有有效根治方法，现有的临床治疗方法只能缓解症状，却不能阻止或逆转疾病进程。近年来我们在临床上应用天麻钩藤饮治疗PD取得满意疗效，但其取效机制仍不明确。本研究以6-羟基多巴胺（6-OHDA）致PD模型大鼠为研究对象，从行为学和神经递质角度探讨天麻钩藤饮对PD的治疗作用及其机理，以期为临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 SD大鼠65只，雄性，SPF级，200～220g，由山东省实验动物中心提供，实验动物许可证号：CSXK（鲁）20140007。

1.2 仪器 多功能脑立体定位仪：Stoelting，美国；低温离心机：型号为MICROMAX RF，Thermo IEC（美国）；高速离心机：型号为1-13，SIGMA（德国）；5μL微量进样器，产自上海安亭微量进样器厂。

1.3 药物 美多芭（多巴丝肼片）：上海罗氏制药有限公司，生产批号H10930198；天麻钩藤饮：天麻9g，钩藤12g，石决明18g，栀子9g，黄芩9g，川牛膝12g，杜仲9g，桑寄生9g，夜交藤9g，茯神9g，益母草9g，药材煎煮2次合并滤液并浓缩。

1.4 试剂 6-羟基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）、阿扑吗啡（APO），均为Sigma公司产品；ELISA试剂盒：大鼠多巴胺（Dopamine，DA），批号201611，联科生物技术有限公司。

2 实验方法

2.1 造模 术前按常规对大鼠进行行为学测试，确认无异常旋转行为后，3%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉。参照文献方法，将大鼠固定在脑立体定位仪上，剪去颅顶的鼠毛，用碘伏常规消毒，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前后囟[3]。纯双氧水擦拭颅骨表面，以前囟为准，根据《大鼠脑立体定位图谱》[4]，确定右侧黑质二坐标：（1）前囟后5.2mm，正中线右侧1.0mm，硬膜下9.0mm；（2）前囟后5.2mm，正中线右侧2.5mm，硬膜下8.5mm。用牙科钻于手术部位小心钻开颅骨，用5μL微量进样器将6-OHDA（溶于含0.02%抗坏血酸的生理盐水中，浓度为2μg/μL）溶液注入右侧黑质部（以1.0mm/min速度缓慢进针），每孔3μL，注射速度为1μL/min，注射完毕后留针5min，然后以1.0mm/min速度缓慢退针。手术完成后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合皮肤切口，肌肉注射庆大霉素（20万单位/只，共7d），待动物清醒后放回笼中饲养。假手术组只注射含0.02%抗坏血酸的等量生理盐水，其余处理同造模组。造模手术10d以后，腹腔注射阿扑吗啡（APO）0.5mg/kg诱发大鼠向健侧旋转，记录开始旋转至30min内的旋转圈数，以旋转圈数平均每分钟超过7次者为合格的PD模型[5]。

2.2 分组与给药 造模成功后，通过随机数字表法将PD模型大鼠随机分为模型组、天麻钩藤饮高剂量组、天麻钩藤饮低剂量组和西药组，另设假手术组，共5组。天麻钩藤饮低、高剂量组分别予天麻钩藤饮11.88g/（kg·d）、47.52g/（kg·d）灌胃，分别相当于临床人日用量的6.25、25倍量；西药组予美多芭75g/（kg·d）灌胃；模型组、假手术组予等量生理盐水灌胃。共干预8周。

2.3 检测指标

2.3.1 行为学测试 行为学测试包括悬挂试验和震颤麻痹评分。于治疗前后分别进行。

悬挂试验（参照Kuribara法改良）[6]：该试验目的是检测大鼠肢体运动的协调情况。将大鼠两前爪悬挂于水平固定的金属杆上，金属杆直径1.5mm，距离地面70cm，记录大鼠悬挂时间，仅一爪抓住绳子属失败。根据悬挂实际进行评分：0～4s评0分；5～9s评1分；10～14s评2分；15～19s评3分；20～24s评4分；25～29s评5分；超过30s评6分。每隔5min测1次，共测3次，取平均值进行统计学分析。

APO诱导的旋转试验[7]：大鼠腹腔内注射APO（0.5mg/kg），10min后观察并记录大鼠的旋转行为，表现为以对侧的前肢或后肢为支撑点，头尾相接，身体弯曲成环状向损伤对侧旋转，共记录30min。

2.3.2 纹状体内DA含量检测 实验结束后处死大鼠，取脑，剥离纹状体，存放于-80℃冰箱。酶联免疫吸附试验（ELISA法）测定纹状体中DA含量，具体方法参考试剂盒说明书进行。

2.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x-±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 实验动物数量分析 假手术组大鼠均全部存活。其余55只大鼠在6-OHDA注射过程中死亡5只，术后10d存活48只。腹腔注射阿扑吗啡诱发大鼠向健侧旋转，从开始旋转至30min内的旋转圈数平均每分钟超过7次者共42只，采用随机数字表法选取40只成功模型，分为模型组、天麻钩藤饮高剂量组、天麻钩藤饮低剂量组和西药组，最终纳入结果分析的大鼠50只，每组10只。

3.2 行为学测试结果

3.2.1 悬挂试验结果 见表1。治疗前模型组、天麻钩藤饮高剂量组、天麻钩藤饮低剂量组和西药组得分均明显低于假手术组（P＜0.01），模型组、天麻钩藤饮高剂量组、天麻钩藤饮低剂量组和西药组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后天麻钩藤饮高、低剂量组和西药组得分均显著高于模型组（P＜0.01），其中天麻钩藤饮高剂量组得分最高，与低剂量组、西药组比较差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量组与西药组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠悬挂试验得分情况比较（±s） 分

表1 各组大鼠悬挂试验得分情况比较（±s） 分

注：**与同时期假手术组比较，P＜0.01；##与同时期模型组比较，P＜0.01；▲与同时期天麻钩藤饮低剂量组、西药组比较，P＜0.05。

假手术组 10 5.50±0.77 5.90±0.32模型组 10 1.30±1.06** 1.00±0.94天麻钩藤饮高剂量组 10 1.40±1.17** 4.50±1.08##▲天麻钩藤饮低剂量组 10 1.60±1.27** 3.30±1.34##西药组 10 1.5±1.27** 3.30±1.89##

3.2.2 旋转试验结果 见表2。治疗前模型组、天麻钩藤饮高剂量组、天麻钩藤饮低剂量组和西药组大鼠旋转圈数组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后天麻钩藤饮高、低剂量组和西药组旋转圈数均明显低于模型组（P＜0.01），其中天麻钩藤饮高剂量组旋转圈数最少，与低剂量组、西药组比较差异有统计学意义（P＜0.01），低剂量组与西药组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠30min旋转圈数比较（±s） 圈

表2 各组大鼠30min旋转圈数比较（±s） 圈

注：**与同时期假手术组比较，P＜0.01；##与同时期模型组比较，P＜0.01；▲▲与同时期天麻钩藤饮低剂量组、西药组比较，P＜0.01。

组别 动物数（只） 治疗前 治疗后假手术组 10 0 0模型组 10 253.18±18.09 256.40±13.43**天麻钩藤饮高剂量组 10 257.20±18.47 148.10±15.15**##▲▲天麻钩藤饮低剂量组 10 246.60±12.92 186.20±12.94**##西药组 10 249.10±18.29 175.90±14.72**##

3.3 各组大鼠治疗后纹状体内DA含量比较 见表3。模型组、天麻钩藤饮高剂量组、天麻钩藤饮低剂量组和西药组大鼠DA含量均明显低于假手术组（P＜0.01），治疗后天麻钩藤饮高、低剂量组和西药组DA含量较模型组显著升高（P＜0.01），其中天麻钩藤饮高剂量组DA含量升高最明显，与低剂量组、西药组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量组与西药组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠治疗后纹状体内DA含量比较（±s）

表3 各组大鼠治疗后纹状体内DA含量比较（±s）

注：**与同时期假手术组比较，P＜0.01；##与同时期模型组比较，P＜0.01；▲与同时期天麻钩藤饮低剂量组、西药组比较，P＜0.05。

组别 动物数（只） DA含量（pg/mL）假手术组 10 56.50±9.35模型组 10 33.45±5.77**天麻钩藤饮高剂量组 10 49.27±6.87**##▲天麻钩藤饮低剂量组 10 41.34±5.55**##西药组 10 42.75±5.21**##

4 讨论

帕金森病是一种临床常见的中枢神经系统退行性疾病，受损部位位于黑质纹状体，该病主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经细胞渐进性减少和神经元内出现路易小体（LB）[8]。目前，国际神经科学界一致认为PD治疗的理想目标是控制症状，提高患者生存质量，延缓病程进展，延长控制症状药物使用的年限，以及减少药物的不良反应和并发症[9]。近年来中医药疗法治疗PD在临床上取得了满意疗效，越来越受到临床医生的重视，具有重要的研究意义。

帕金森病属于中医“颤证”范畴，病因多为年老体虚，肝肾亏损，肝风内动，气血阴阳亏虚，筋脉失养，治疗当以补肾平肝息风为法。而天麻钩藤饮具有平肝息风、补益肝肾之效，切中病机，为临床治疗PD的常用方剂。现代药理研究发现，天麻的有效成分主要是天麻素和天麻苷元，有临床研究证实天麻素能够使PD合并轻度认知功能损害患者的认知功能明显改善，尤其在视空间与执行、语言流畅及延迟记忆等方面改善明显[10]。动物实验表明，天麻素可以抑制多巴胺代谢率，使多巴胺含量升高，并对多巴胺能神经元的形态及功能有保护作用，减慢多巴胺神经元的代谢速度进而减少多巴胺的自身氧化，提高多巴胺神经元摄取中的酪氨酸和胞质内酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺脱氢酶（DDC）的活性，促进多巴胺生成，以对抗多巴胺神经元死亡造成的多巴胺含量下降[11-12]。本研究结果发现：天麻钩藤饮可以改善PD大鼠行为学症状，延长PD大鼠悬挂时间，减少阿扑吗啡诱导的旋转圈数，其中高剂量组疗效最明显，低剂量组与西药组疗效相当；干预8周后，天麻钩藤饮高剂量组大鼠纹状体DA含量明显升高，与低剂量组、西药组比较差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量组与西药组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。由此我们推测，天麻钩藤饮治疗帕金森病的取效机制可能与促进PD大鼠内源性多巴胺分泌，有效改善PD大鼠脑内微环境和神经元代谢有关。

综上所述，天麻钩藤饮可以明显改善PD大鼠行为学症状，提高黑质纹状体内多巴胺含量，如果将其用于轻度或早期帕金森患者，可推迟临床使用西药，减少西药用量或缩短疗程，从而减少西药治疗的不良反应，值得进一步推广。本次实验还未涉及单胺类神经递质相关代谢指标的具体起效时间、起效通路以及相关蛋白、基因等指标，还有很多内容需要探索及深入研究，以期为临床应用天麻钩藤饮治疗PD提供更加明确的科学依据。

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