血清TLR-4在复苏后肺损伤中的表达与机械通气影响＊

毛洪涛，黄 亮，曹春水，熊华威，刘 勇

(南昌大学第一附属医院急诊科，南昌 330006)

复苏后综合征（PRS）是指心搏突然骤停时机体由于严重缺氧、缺血、酸中毒或实施心肺复苏（CPR）后体内大量释放多种炎症因子及自由基，导致各种有害物质进入机体组织细胞内，引发的机体组织细胞弥漫性损伤，进而出现机体多器官功能障碍综合征（MODS）[1]。肺由于其结构和功能的特殊性，是复苏后较容易损伤的脏器之一。TLR-4是Toll样受体家族中的一类，是固有免疫和适应免疫极为重要的天然免疫抗体，在介导中性粒细胞活化及TNF-α肺内的聚集、引起肺内产生大量的活性氧自由基（ROS）导致的损伤中起至关重要的作用[2]。为改善肺功能、减少肺损伤并改善心脑等重要器官氧供，机械通气是最佳治疗手段，但随着研究的深入，人们发现不当的通气策略造成的并发症和呼吸机相关性肺损伤亦能给患者造成严重后果，机械通气策略的选择将影响患者预后。本研究通过检测复苏后综合征患者在不同潮气量及呼气末正压(PEEP)机械通气条件下氧合指数（OI）、急性肺损伤评分（LIS）、血清TLR-4水平，探讨心肺复苏后的合理机械通气方式。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院2013年1月-2016年1月收治的心搏骤停后复苏后综合征患者24例，其中呼吸衰竭6例 (25%)，急性心肌梗死5例(20.8%)，脑血管意外4例(16.6%)，有机磷中毒3例(12.5%)，窒息 3 例(12.5%)，休克 2 例(8.3%)，一氧化碳中毒1例(4.1%)。采用数字表法随机分为A1、A2、A3、B1、B2、B3组，每组 4例。 A1组采用低潮气量(6ml/kg)+低 PEEP〔3cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)〕，男3 例，女 1 例；年龄 45-66 岁，平均（52.3±8.2）岁。A2组采用低潮气量(6ml/kg)+中等PEEP(6cmH2O)，男 2 例，女 2 例，年龄 47-59 岁，平均（53.3±5.9）岁。A3组采用低潮气量 (6ml/kg)+高PEEP(12cmH2O)，男 3例，女 1例，年龄 48-61岁，平均（55.1±7.8）岁。 B1组采用常规潮气量(10ml/kg)+低PEEP(3cmH2O)，男 2 例，女 2 例，年龄 50-65 岁，平均（57.7±7.3）岁。B2组采用常规潮气量(10ml/kg)+中等 PEEP(6cmH2O)，男 2例，女 2例，年龄 48-69岁，平均（55.9±8.6）岁。B3组中采用常规潮气量(10ml/kg)+高 PEEP(12cmH2O)，男 2 例，女 2 例，年龄50-67岁，平均（56.3±6.2）岁。各组患者的性别、年龄具有均衡性，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究方案经本院伦理委员会同意，并与研究患者委托人签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 入选患者入院时判断为心搏骤停，立即进行心肺复苏术，心室纤颤者先给予除颤，并立即按心肺复苏指南要求行胸外按压，采用经口气管内插管术，插管成功后立即接呼吸机容量控制通气，自主循环恢复(ROSC)前每3min静脉注射肾上腺素1mg，ROSC后停止心肺复苏术。

1.2.2 各组采用PB840型呼吸机进行机械通气，选择容量控制通气模式，初始设计呼吸频率为16次/min，吸入氧浓度(FiO2)为 40%，吸呼比为 1：2，潮气量及PEEP按各组实验要求设置。

1.2.3 观察指标 ROSC后开始计时，观察并记录各组患者 1h、6h、12h、24h 时氧合指数(OI)、血气分析、24h行床边胸片，计算急性肺损伤评分（LIS）（见表1）。各时间点抽取各组患者外周静脉血4ml，采用ELISA法检测血清中TLR-4水平。

表1 LIS评分表

1.2.4 TLR-4检测 外周静脉血样注入无菌真空采血管，3000r/min离心，取上层血清冻于-20℃冰箱备测。采用美国R&D公司生产试剂盒：Human TLR-4 ELISA Kit。严格按照试剂使用说明书进行操作。⑴准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温30min；⑵配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液；⑶加标准品和待测样本：取酶标包被板，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加标准品50μl；待测样本孔中先加入待测样本 10μl，再加样本稀释液40μl(即样本稀释5倍)；空白对照不加；⑷温育：37℃水浴恒温箱温育30min；⑸洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，酶标洗板机洗板；⑹加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μl，空白对照孔不加；⑺温育；⑻洗板；⑼显色：每孔先加入显色剂A液50μl，再加入显色剂B液50μl，37℃避光显色15min；⑽终止：取出酶标板，每孔加终止液 50μl，终止反应(颜色由蓝变黄)；⑾测定：以空白孔调零，终止后15min内，用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)；⑿计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样本浓度。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行数据统计与分析，计量资料以s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OI组内各时间点比较，各组24h与1h、6h、12h相比，OI降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；组间各时间点比较，A2组24h与其他各组同时间点相比，OI升高，差异均有统计学意义（P＜0.05)。见表2。

表2 各组OI比较

表2 各组OI比较

注：与组内 24h 时比较，*P＜0.05；与 A2 组 24h 时比较，#P＜0.05。

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2.2 急性肺损伤评分（LIS）各组24h LIS分值为0.5-2.5 分，平均（1.5±1.0）分，A2 组与其他各组相比，LIS低于其他各组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。 见表 3。

表3 各组24h LIS比较

表3 各组24h LIS比较

注：A2 组与其他各组相比，★P＜0.05。

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2.3 TLR-4水平 各组血清TLR-4水平随着时间延长均升高，组内比较，各组12h、24h较1h时间点TLR-4水平升高（P＜0.05）；与其他各组同时间点相比，A2组12h、24h时TLR-4水平低于其他各组（P＜0.05）。 见表 4。

3 讨论

尽管目前心肺复苏技术在不断的提高和推广，部分心脏骤停患者能够恢复自主循环，但是自主循环建立后，机体往往会出现复苏后综合征，出现全身反应性的缺血再灌注，机体的神经、血管活性物质发生改变，产生大量的细胞因子、粘附因子等的变化，最后引发全身炎症反应综合征（SIRS)，出现多脏器功能障碍（MODS），最终导致病人的死亡[1]。肺脏是心肺复苏中较易损伤的器官，机械通气是治疗复苏后综合征的重要手段，可迅速纠正缺氧，促进心、肺、脑功能的早期恢复[3]，在复苏后综合征患者治疗中的支持作用最为关键，但是机械通气在产生明显益处的同时亦可能发生并发症[4]，呼吸机相关肺损伤（VILI）是机械通气常见的并发症，可对复苏后综合征患者造成双重打击。近年来研究发现，机械通气期间由肺牵张引起的机械转导还可激活一系列细胞的信号通路，释放炎症因子，引起“生物伤”[5]。

表4 各组TLR-4水平（ng/ml）比较

表4 各组TLR-4水平（ng/ml）比较

注：与组内 1h 时比较，☆P＜0.05；与 A2 组对应时间点比较，△P＜0.05。

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急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（ALI/ARDS）通常表现为顽固性低氧血症，主要是由于肺内从右向左的分流，肺泡不张及肺泡腔水肿而引起通气/换气比例失调所致。氧合指数（OI）即动脉血氧分压比吸氧浓度（PaO2/FiO2），简便经济，能较好地反映机体吸氧条件下的缺氧情况，且与肺内血液分流量呈密切相关，是早期发现ALI的有效指标。急性肺损伤评分（LIS）是1988年由Murray等提出的评价肺损伤严重程度的计分标准，可对肺损伤进行比较和半定量。

肺保护性通气策略，即限制潮气量(5-8ml/Kg）和平台压（＜30cmH2O），同时使用一定的PEEP维持肺泡的开放，减少肺“容积伤”、“剪切伤”的发生，最终降低肺“生物伤”的严重程度，降低急性呼吸窘迫综合征的发生[6，7]。

本研究结果显示，ROSC各组24h OI均明显降低（P＜0.05），均低于 300，LIS 分值 0.5-2.5 分，表明心肺复苏后24h呈现急性肺损伤改变；尽管肺损伤病因机制复杂，但A2组24h OI、LIS与其他各组相比，有统计学差异（P＜0.05)，提示设置低潮气量(6ml/kg)配合中等PEEP(6cmH2O)有助于改善氧合，减轻肺损伤程度。

Toll样受体（TLRs)分布广泛，主要表达于单核细胞、巨噬细胞等细胞膜上，是一个天然免疫的家族，目前已经出克隆11种TLRs，TLR-4是Toll样受体家族中的一类，其中TLR-4作为“门户”蛋白启动机体的炎症链式反应，在跨膜信号转导受体家族TLRs中占有重要的位置，目前关于TLR-4作为脂多糖受体介导细菌感染等炎症反应已基本明确；在患者感染病原体后，血清中TLR-4表达量升高，随着炎症发展至脓毒症时TLR-4表达量明显升高[8]。有研究应用ELISA法检测脓毒症患者外周血清TLR-4浓度证实其表达水平与脓毒症严重程度呈正相关[9]。但是研究也发现TLR-4在没有脂多糖及细菌产物的情况下也同样发挥着重要的作用，研究表明在缺血再灌注、创伤等损伤中，TLR-4可通过特殊的信号转导通路，引起炎症细胞活化而导致更多的损伤[10]。在缺血再灌注引起的肺部损伤最可能机制是肺泡巨噬细胞上的TLR-4与一些内源性配体如活性氧族、热休克蛋白60、70等，及其他细胞外基质成分与TLR-4结合启动炎症反应，这些内源性配体可来自肺本身，也可来自全身组织缺血再灌注后随着血液循环进入肺组织；未有脂多糖的情况下，TLR-4能够介导缺血后明显的肺损伤和脑损伤，引起TNF-α、ILs、NO等前炎症因子的释放，TNF-α 又可诱导 IL-1、IL-6、IL-8的生成，还可激活巨噬细胞、白细胞，促进血小板激活因子、NO、前列腺素和白细胞三烯等的产生，细胞因子相互作用引起的炎性介质过度释放，产生炎性因子级联放大反应，最终导致患者器官损害[11]。

本研究结果显示，各组1h、6h时TLR-4水平差异无显著性，A2组12h后TLR-4水平显著低于其他各组。表明低潮气量 （6ml/kg）+中等PEEP(6cmH2O)在12h后稳定内环境的作用优于其他通气方式，提示机体内炎症反应严重程度与呼吸机参数的设置相关；合理的机械通气方式可将机械通气对复苏后综合征患者的肺损伤炎症反应降至最低，可能因为低潮气量使肺的膨胀和牵拉相对较小，引起的损伤较少。但是较少的潮气量可导致肺扩展受限，小气道不张，如果时间较长，会导致肺微小不张，肺泡塌陷，呼吸死腔增加，分泌物不能排除，最终引起低氧血症、肺部感染。为了避免不利影响，在使用小潮气量通气的同时加用中等PEEP，PEEP可使塌陷的支气管和闭合的肺泡重新扩张，提高功能残气量及肺部顺应性，改善通气和氧合，且能够减少肺内分流，但高PEEP也可引起病人低血压或者其他不良反应。因此临床应用中需选择合理PEEP，低潮气量（6ml/kg）+中等PEEP(6cmH2O)可降低机体的炎症反应，减轻患者的肺损伤。

综上所述，本研究初步说明，心肺复苏后血清TLR-4表达升高并呈现肺损伤表现，低潮气量（6ml/kg）+中等 PEEP（6cmH2O）可能是心肺复苏后24h内较为合理的机械通气方式。

[1]刘大为，邱海波.实用重症医学[M].北京：人民卫生出版社，2010：347-348.

[2]徐建波，吴河水.肺泡巨噬细胞Toll样受体4在肝脏缺血再灌注损伤小鼠肺组织中的表达及意义 [J].中华肝胆外科学杂志，2008，14（2）：115-117.

[3]吴政庚，周从阳.心肺复苏中呼吸支持对策的临床应用[J].江西医药，2008，43(10)：1114-1117.

[4]曹启生.机械通气后并发急性呼吸窘迫综合征的相关危险因素研究[J].中国全科医学，2011，14（12）：3930.

[5]Yang M，Ahn HJ，Kim K，et al.Does a protective ventilation strategy reduce the risk of pulmonary complications after lung cancer surgery randomized controlled trial[J].Chest，2011，139(3)：530-537.

[6]张军，何文胜，胡远，等.依达拉奉对单肺通气老年患者肺功能的影响[J].中华全科医学，2013，11（2）：216-217.

[7]王红鸾，蔡金莲，付强，喻杰.保护性机械通气治疗老年COPD伴肺大泡合并Ⅱ型呼吸衰竭的临床观察 [J].江西医药，2014，49(3)：189-191.

[8]Tsujimoto H，Ono S，Efron PA，et al．Role of Toll-like receptors in the development of sepsis[J]．Shock，2008，29(3)：315－321．

[9]齐眀禄，杨敬平，银雪，等.外周血中TLR4、TIRAP表达与脓毒症相关性研究[J].临床肺科杂志，2015，20(1)：19-22.

[10]李克思，姚尚龙，马利，等.机械通气对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4表达的影响 [J].中国危重病急救医学，2007，2（19）：73-76.

[11]Barsness KA，Arcaroli J，Harken AH，et al.Hemorrhage induced acute lung injury is TLR-4 dependent[J].Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，287：R592-R599.