SURVIVIN在无精子症患者睾丸组织中的表达研究＊

黎衍敏，邓小林，杨 军

(1、江西省赣南医学院第一附属医院泌尿外科，赣州 341000；2、江西省赣州市人民医院泌尿外科，赣州 341000)

SURVIVIN是近些年新发现的一种凋亡抑制蛋白，也是迄今为止被发现的最强的凋亡抑制蛋白之一，其可有效抑制细胞凋亡并能促进细胞分裂[1]，相关研究表明：SURVIVIN在人类恶性组织中尤其是各类恶性肿瘤中高表达，而在正常分化的组织中却很少有表达[2]。虽然目前关于SURVIVIN在男性无精子症患者睾丸组织中的表达方面的研究较少，但许多资料表明，SURVIVIN与精子的生成有一定相关性[3，4]。本文旨在通过研究SURVIVIN在无精子症患者睾丸组织中的表达情况，初步探讨SURVIVIN与精子生成的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性收集我院2015年2月-2016年11月期间收治的40例无精子症患者为研究对象。其中梗阻性无精子症患者其生精功能正常，共 10 例，年龄 24-42 岁，平均（28.24±1.82）岁。非梗阻性患者30例，依据患者睾丸穿刺活检病理结果分为：生精功能低下患者10例，年龄24-40岁，平均年龄（23.43±2.12）岁；生精功能阻滞患者10 例，年龄 25-39 岁，平均年龄（29.32±1.85）岁；唯支持细胞综合症患者10例，年龄23-41岁，平均年龄（23.43±1.67）岁。研究开始前已征得患者同意，患者均已签署《知情同意书》；本次研究已通过本院医学伦理委员会审查，研究符合医学伦理标准。

1.2 方法 使用购自上海通蔚生物科技有限公司的兔抗人SURVIVIN多克隆抗体；使用购自上海拜力生物科技有限公司的免疫组化试剂盒；选用购自南京迈博生物科技有限公司的DAB显色试剂盒。选用免疫组化二步法对已备切片行SURVIVIN检测[5]。具体操作如下：以4μm厚度为准，对石蜡标本连续切片，按照常规方法行二甲苯脱蜡以及乙醇水化，用PBS液进行3次洗涤，每次3min；用含量为3%的双氧水处理5min；再用PBS液进行三次洗涤，每次3min；用pH值为6.2的柠檬酸进行高温修复；再次用PBS液进行3次洗涤，每次3min；在一抗室温状况下孵育1.5h；依旧用PBS液进行3次洗涤，每次3min；于二抗室温状况下孵育30min；再用PBS液进行3次洗涤，每次3min，用DAB实现显色，通过显微镜对显色情况进行观察，并选择在合适时机流水从而终止显色反应。最后，用苏木精对石蜡切片进行复染，做好脱水、透明以及对石蜡切片的重新固定。

1.3 判断标准 通过光学显微镜对生精细胞进行观察，如若发现细胞核或者细胞浆中出现黄色颗粒，即可认定为阳性表达。研究用显微镜倍数为400，对5个睾丸曲细精管横切面视野进行随机观察。选用免疫反应评分(IRS)对SURVIVIN蛋白表达进行半定量分析，即用睾丸曲细精管横切面内阳性表达的细胞所占百分比(PP)计分和染色强度(SI)计分相乘。其中，PP计分标准如下：百分比小于1%的，记为0分；百分比在1%-25%之间的，记为1分；百分比在26%-50%之间的，记为2分；百分比在51%-75%之间的，记为3分；百分比大于75%的，记为4分。SI计分标准如下：显示无色的，记为0分；显示淡黄色的，记为1分；显示棕黄色的，记为2分；显示褐色的，记为3分。SURVIVIN阳性表达评价标准如下：当IRS计分为0时，判定表达为阴性，IRS计分在1-4分之间时，判定表达为弱阳性，当IRS计分在5-8分之间时，判定表达为中度阳性，当IRS计分在9-12分之间时，判定表达为强阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示；两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义；SURVIVIN蛋白表达强度与生精功能障碍的关系采用Spearman相关性分析进行检验。

2 结果

2.1 SURVIVIN蛋白在各组睾丸组织中的表达 通过显微镜观察提示，在生精细胞的细胞核中，SURVIVIN蛋白有阳性染色表达。结果如下：SURVIVIN蛋白在生精功能正常患者睾丸组织中，细胞核呈现出褐色，IRS计分9-12分，为强阳性表达；SURVIVIN蛋白在生精功能低下患者睾丸组织中，细胞核呈现出棕黄色，IRS计分为5-8分，为中度阳性表达；SURVIVIN蛋白在生精功能阻滞患者睾丸组织中，细胞核呈现出淡黄色，IRS计分为1-4分，为弱阳性表达；SURVIVIN蛋白在唯细胞支持综合症患者睾丸组织中，细胞核为无色，IRS计分为0分，为阴性表达(图1)。

图1 各组睾丸组织免疫组化图示

2.2 不同类型无精子症睾丸组织中SURVIVIN蛋白的阳性表达状况 不同类型无精子症睾丸组织中 SURVIVIN蛋白的阳性表达状况 (表 1)；Spearman相关性分析结果显示，相关系数为-0.785，P＜0.05，说明男性生精功能障碍的严重程度与SURVIVIN蛋白的阳性表达强度呈负相关性。

3 讨论

根据相关临床研究报告显示，受到社会经济发展节奏与人们日常行为习惯等的影响，目前在全球范围内都存在着不同程度的不育症问题，这导致越来越多的国家承受着人口低速增长的威胁[6]。导致男性不育的病因有许多，无精症是众多病因中比较典型的一种，无精子症的定义为精液常规检查中未见精子，且精液离心后镜检亦未见精子，重复3次检查结果相同，排除不射精和逆行射精，即可诊断为无精子症；无精子症可分为非梗阻性无精症(NOA)和梗阻性无精子症(OA)。前者是由于睾丸本身功能障碍，不能产生精子；后者睾丸生精功能正常，但由于各种原因导致精道阻塞使精子无法排出体外而造成的无精子症。根据相关临床分析结果显示，由于无精子症导致的不育，约占男性不育症的10%～15%，而男性无精或者重度少精的共同特点之一就是生殖细胞的过度凋亡[7]。与其他细胞的凋亡相似，精子的凋亡，也是由于各种生理或者病理因子导致的。正常状态下，精子的生成速率很高，但其成熟率却相对较低，精子中成熟部分的数量约占总量的25%-30%之间。在正常状态下，生殖细胞的增殖与凋亡之间具有一定的均衡调节，这是保证精子正常生成的一个内在机制[8]。

表1 SURVIVIN蛋白在各组睾丸组织中的表达

因此，生殖细胞凋亡的过程，实际上就是避免精子过度产生，降低异常精子出现的概率，最大程度的保持精子的正常生成[9]。而凋亡抑制蛋白，可以有效的抑制细胞的凋亡。SURVIVIN是近些年新发现的一种凋亡抑制蛋白，并且被确认为是目前被发现的最强的凋亡抑制蛋白之一。目前许多资料显示，SURVIVIN在肿瘤组织中表达水平较高，但越来越多的证据显示，SURVIVIN并非是肿瘤特异性蛋白，其在人体造血系统中也可被检出[10]；而人体造血与生精，两者的过程是具有相似性[11]。已有文献报道在小鼠的生精细胞中，有SURVIVIN表达[12]。但是，关于SURVIVIN在男性无精子症患者睾丸组织中的表达研究，以及SURVIVIN与精子生成的关系，目前这方面的研究还比较少。

综上，SURVIVIN与精子的生成有一定的关联，对男性不育症的诊治有所帮助，本实验还需进一步的研究，明确其在精子发生中的机制。

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