谷氨酰胺转氨酶浓度对搅拌型酸羊乳贮存期品质的影响

王银，张富新，邵玉宇，王毕妮，张哲源，冯翠娇

(陕西师范大学 食品科学与营养工程学院，陕西 西安，710119)

羊乳具有较高的营养价值，其富含蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质、维生素以及生物活性物质[1]。羊乳可加工成乳粉、酸乳、奶酪等多种乳制品，其中搅拌型酸羊乳以其较好风味和保健功能深受消费者的喜爱。由于羊乳中αs1-酪蛋白含量较低及季节性成分的影响[2]，羊乳的凝乳特性较差，在搅拌和运输的过程中凝乳脆弱，导致组织状态破坏、乳清析出，从而失去商品价值，为了解决上述问题，人们通常在羊乳中添加果胶、黄原胶等稳定剂来改善搅拌型酸乳的黏度和持水性[3]，但这些方法对搅拌型酸羊乳的口感及其风味造成一定的影响。近年来，随着食品生物技术的发展，人们利用酶处理技术来提高食品的加工特性，其中谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，TG)具有催化蛋白质侧链上谷氨酰胺残基与赖氨酸之间发生交联反应形成共价键的蛋白酶，可改变蛋白质水合能力、溶解度、持水性、黏度、弹性等凝胶化性能[4-5]，在乳制品[6]、豆制品[7]、肉制品[8]等加工领域已经广泛应用。乳中的蛋白质是TG的良好底物[9]，可使乳蛋白质分子内和分子间发生交联[10]，提高凝胶特性和质量品质。然而乳蛋白交联程度取决于TG浓度、处理时间、pH等[11-13]，其中TG浓度是影响乳蛋白交联的主要因素[14]。因此本研究应用不同浓度的TG处理羊乳后，用其制备搅拌型酸羊乳，研究搅拌型酸羊乳贮存期pH、黏度、持水性、风味物质、乳酸菌数的变化，为提高搅拌型酸羊乳的品质提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊乳，西北农林科技大学教学试验农场的新鲜混合羊乳(乳蛋白的质量分数为3%)；酸奶发酵剂，丹尼斯克YO-MIX187(由嗜热链球菌Streptococcusthermophilus和保加利亚乳杆菌Lactobacillusbulgaricus组成)；谷氨酰胺转氨酶(TG-N，100 u/g)，江苏一鸣生物科技有限公司；MC和MRS琼脂培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；丁二酮，美国Sigma公司；SDS、甘氨酸和Tris，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳槽和PowerPacTMBasic电泳仪，美国Bio-Rad公司；UV-5100紫外分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司；Z 206A离心机，德国Hermle公司；DV2TLVTJ0黏度计，美国BROOKFIELD公司；PHSJ-4A实验室pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；ChemiDoc-it 510化学发光成像仪，美国UVP公司-lb；GSP-9080MBE隔水式恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 TG处理羊乳

新鲜羊乳于90 ℃杀菌5 min后，迅速冷却到40 ℃，按乳蛋白含量添加TG，使羊乳中TG浓度分别达到1、2、3 u/g蛋白，在40 ℃下处理2 h后，80 ℃灭酶5 min，冷却至42 ℃备用。

1.3.2 搅拌型酸羊乳的制备

取TG处理后的羊乳，加入质量分数为0.02%的发酵剂，42 ℃发酵至凝乳，冷却至20 ℃，匀速搅拌2 min之后分装，并且在4 ℃下贮存，并以不添加TG为对照。

1.3.3 黏度

参考SOLEYMANPUORI[15]的方法，用DV2TLVTJ0黏度计测定搅拌型酸乳的黏度，转子LV-2主轴(No.62)，取30 mL样品注入测试容器，将转筒完全浸没到样品中，测试温度4 ℃，转速12 r/min，在第59秒时记录数据。黏度单位mPa·s。

1.3.4 持水性

参考ERCILI[16]的方法。取10 g搅拌型酸羊乳于离心管中，在3 500g下离心10 min，称取上清液(m)，用(1)式计算样品的持水性。

(1)

1.3.5 pH

使用精密pH计测定。

1.3.6 乳酸菌菌落数

参考GB 4789.35 — 2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》方法检测样品中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，单位为CFU/mL。

1.3.7 风味物质

参考李妍[17]的方法，取搅拌型酸羊乳样品30 mL，加入等体积的16%三氯乙酸溶液于离心管中，充分摇匀后，4 500g离心10 min，将上清液用滤纸过滤后，取澄清的上清液测定乙醛和丁二酮含量，同时以无菌的鲜羊乳作为对照。

1.3.7.1 乙醛

取处理过的上清液10 mL于锥形瓶中，并加入2.0 mL 1%的NaHSO3溶液，摇匀，室温下放置1 h后，加入1mL 1%淀粉溶液，先用0.1 mol/L的碘标准溶液滴至接近终点，再用0.01 mol/L碘标准溶液滴定至终点淡蓝紫色，并且30 s内不褪色。然后再加20 mL 1 mol/L的NaHCO3，混匀至颜色消失，用0.01 mol/L碘标准溶液滴定至终点，记录最后消耗的标准碘液的体积，同时按上述方法做空白试验。并用(2)式计算：

(2)

式中：V1，酸乳上清液滴定所消耗I2标准溶液的体积，mL；V2，空白滴定所消耗I2标准溶液的体积，mL；C，1/2 I2标准溶液的浓度，mol/L；0.022，乙醛化学反应基本单位，g；10，乙醛样品称样量，mL。

1.3.7.2 丁二酮

取2支20 mL试管，各加入10 mL上清液，第1支试管中加入0.5 mL 1%的邻苯二胺溶液，第2支试管不加做空白对照，摇匀后置于黑暗处30 min。待反应完全后第1支试管中加2.0 mL 4.0 mol/L HCl，第2支试管加2.5mL HCl，混匀后以第2支试管作为参比溶液，选用石英比色皿于335 nm的波长下测定吸光度值。实验得到标准曲线方程：y=0.080 9x+0.063 7，R2=0.998 6，其中y为吸光值，x为丁二酮浓度，然后将吸光值代入标准曲线方程计算样品中丁二酮浓度，单位为mg/L。

1.3.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-PAGE电泳采用LAEMMLI[18]的方法，略作修改。将TG处理的羊乳用去离子水稀释15倍，用4倍上样缓冲液混合均匀，置于沸水浴中5 min使蛋白质变性后，在1 2000 r/min下离心5 min，上层溶液为上样液。配制5 mL 13.5%分离胶(2.25 mL 30%丙烯酰胺、1.25 mL pH 8.8 tris-Hcl、50 μL 10% SDS、50 μL 10%APS、5 μL TEMED、1.4 mL dd H2O)和2.5 mL 3.75%的浓缩胶(0.313 mL 30%丙烯酰胺、0.313 mL pH 6.8 tris-Hcl、25 μL 10% SDS、37.5 μL 10%APS、3.75 μL TEMED、1.813 mL dd H2O)。制胶完成后，取上样液10 μL缓慢加入上样孔中，开始电泳，先将电压调至75 mV，在溴甲酚蓝跑出浓缩胶后将电压调至200 mV，直到溴甲酚蓝将要跑出分离胶时停止电泳。从玻璃板中取出凝胶，用染色液(1 g考马斯亮蓝R-250、450 mL甲醇、100 mL冰乙酸定容至1 L)在摇床中隔夜染色。染色后，将凝胶用脱色液(100 mL甲醇、100 mL冰乙酸定容至1L)处理4 h，每1 h换1次，脱色过后用ChemiDoc-It图像处理系统拍照并进行分析。

1.3.9 数据处理

采用SPSS Statistics 22.0 统计分析软件的ANOVA方法对实验数据进行差异显著性检验分析，以p<0.05为差异显著。试验重复3次。

2 结果与讨论

2.1 TG浓度对搅拌型酸羊乳贮存期pH的影响

不同TG浓度处理羊乳后制备的搅拌型酸羊乳在贮存期pH的变化见图1。

图1 TG浓度对搅拌型酸羊乳贮存期pH的影响Fig.1 Effect of TG concentration on the pH value on the stirred goat yogurt during the storage period

由图1可见，搅拌型酸羊乳在贮存期的pH均呈现降低的趋势。但不同TG浓度处理的酸乳的pH有明显差别。与未经TG处理的对照组相比，经TG处理的搅拌型酸羊乳在贮存期pH显著增加(p<0.05)，且TG浓度越大，搅拌型酸羊乳的pH越高，说明TG处理有抑制搅拌型酸羊乳贮存期间的产酸能力。羊乳经TG处理后在制作酸乳时，由于TG交联乳蛋白作用，使乳中易被乳酸菌利用的小分子肽、氨基酸、蛋白质发生交联导致乳酸菌的产酸能力下降，pH升高[19]。ABDULQADR[20]报道，TG处理羊乳后，酸羊乳的pH明显高于未经TG处理的对照组；牟英杰[21]也发现用浓度为0.2 μ/g蛋白的TG处理牛乳后，制备的搅拌型酸牛乳的pH明显增加，这与本研究的搅拌型酸羊乳结果一致。

2.2 TG浓度对搅拌型酸羊乳贮存期间黏度的影响

不同TG浓度处理羊乳后制备搅拌型酸羊乳在贮存期的黏度变化见图2。

图2 TG浓度对搅拌型酸羊乳贮存期黏度的影响Fig.2 Effect of TG concentration on the viscosity of stirred goat yogurt during the storage period

如图2所示，在搅拌型酸羊乳贮藏期间，随着贮存期的延长，搅拌型酸羊乳的黏度逐渐增加。但不同TG浓度对其贮存期间的黏度有较大的影响，随着TG浓度的增加，搅拌型酸羊乳的黏度逐渐增加(p<0.05)。当用TG浓度为2 u/g蛋白时处理后，在贮存21d时，搅拌型酸羊乳的黏度与对照组相比，黏度提高53%。表明通过TG处理羊乳制备的搅拌型酸羊乳，有利于提高其贮存期间的黏度，提高酸乳的稳定性。关于TG处理提高酸乳黏度已有文献报道，FARNSWORTH[22]以2 u/g蛋白的TG浓度处理牛乳时，搅拌型酸牛乳的黏度提高了3.5倍；JAROS[23]报道称牛乳中添加TG，由于交联作用增强了酸乳中蛋白质之间相互作用，导致了搅拌型酸牛乳的黏度显著增加。本实验结果表明用TG浓度为2～3 u/g蛋白处理羊乳，可显著提高搅拌型酸羊乳贮存期间黏度，有利于提高酸乳的稳定性。

2.3 TG浓度对搅拌型酸羊乳贮存期间持水性的影响

不同TG浓度处理羊乳制备的搅拌型酸羊乳贮存期的持水性见图3。

图3 TG浓度对搅拌型酸羊乳贮存期持水性的影响Fig.3 Effect of TG concentration on water holding capacity of stirred goat yogurt during the storage period

酸乳的持水性反映酸乳凝胶对水分的保持能力，对搅拌型酸乳而言，持水性反映酸乳在贮存期间乳清析出能力，持水性越高，酸乳的乳清析出越少。由图3可知，在搅拌型酸羊乳贮存期间，酸乳的持水性呈现先升高后降低的趋势，其中在贮存14 d时，酸羊乳的持水性最高，贮存14 d后，其持水性均有所降低。在搅拌型酸羊乳贮存期间，TG处理羊乳后制备的搅拌型酸羊乳持水性显著高于对照组(p<0.05)，且随着TG浓度的增加，持水性逐渐升高，当TG处理浓度为2 u/g蛋白时，搅拌型酸羊乳在第14天的持水性比对照组提高17%。有关TG浓度对酸乳持水性的影响的报道有较大区别，杨洋[24]研究不同TG浓度对搅拌型酸牛乳持水性的影响，在TG浓度为8 u/g蛋白时，搅拌型酸牛乳的持水性达到最大；FARNSWORTH[22]在羊乳中加入浓度为2 u/g蛋白的TG时，酸羊乳的持水性提高了8%。lORENZEN等人[25]报道TG处理原料乳催化共价键的生成，缩小酸乳凝胶孔径，增强酸乳凝胶三维网状结构的持水性。本研究通过TG处理羊乳，在其浓度为2～3 u/g蛋白时，制备的搅拌型酸羊乳具有较高的持水性。

2.4 TG浓度对搅拌型酸羊乳风味物质含量的影响

酸乳的风味主要由发酵过程中乳酸菌产生的乙醛和丁二酮形成[26]，通过不同TG浓度处理羊乳后，制备的搅拌型酸羊乳在贮存期间乙醛丁二酮变化见图4。

图4 TG浓度对搅拌型酸羊乳贮存期风味物质的影响Fig.4 Effect of TG concentration on the flavor substance of stirred goat yogurt during the storage period

由图4可知，搅拌型酸羊乳在贮藏期间乙醛和丁二酮的含量明显减少，与对照组相比，经TG处理制备的搅拌型酸羊乳的乙醛和丁二酮含量降低(p<0.05)，且随着TG浓度的增加，乙醛和丁二酮的含量在逐渐降低。在酸羊乳发酵的过程中，典型的风味物质由乳酸菌的代谢产生羟基类化合物，尤其是乙醛和丁二酮[27]。OZER[28]采用浓度为0～0.5 g/L的TG处理牛乳后，制备的酸牛乳的乙醛含量与TG浓度呈负相关。丁二酮在搅拌型酸乳中的含量较低[29]，MARIA[27]分析了TG处理原料乳过后制备的酸乳的丁二酮含量明显降低(p<0.05)，这与本试验结果相一致。酸乳的风味物质主要是在低温贮存过程中产生的，在低温贮存期乳酸菌活力减弱，可能对风味物质产生一定影响，同时TG处理后形成的凝胶也可能对风味物质产生一定的影响。

2.5 TG浓度对搅拌型酸羊乳贮存期乳酸菌的影响

不同TG浓度处理羊乳后，制备的搅拌型酸羊乳中的保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌在贮存期菌落数的变化情况见图5。

图5 TG浓度对搅拌型酸羊乳贮存期乳酸菌的影响Fig.5 Effect of TG concentration on Lactobacillus in stirred goat yogurt during the storage period

由图5可知，搅拌型酸羊乳在贮存期时，嗜热链球菌呈现先升高后降低的趋势，且在贮存7～14 d时，嗜热链球菌含量较高，而保加利亚乳杆菌在贮存期变化不大。同时可以看出，TG处理的搅拌型酸羊乳中嗜热链球菌含量明显降低(p<0.05)，且随着TG浓度的增加而降低；而TG的搅拌型酸羊乳中保加利亚乳杆菌变化不大，这表明，TG对搅拌型酸羊乳贮存期间嗜热链球菌有抑制作用，而对保加利亚乳杆菌无明显影响。OZER[28]报道，TG处理脱脂牛乳后制作的酸牛乳中的益生菌菌落数明显降低，这与本试验结果一致。NEVE[25]指出TG导致酸乳中乳酸菌含量的减少是由于乳酸菌生长所需的小分子肽和氨基酸被TG的催化作用所结合，而交联的小分子肽和氨基酸就不能被乳酸菌所利用，从而抑制了乳酸菌的生长。总之，经TG处理制备搅拌型酸羊乳显然乳酸菌含量有所降低，但其总菌数仍大于106cfu/mL，表明TG处理羊乳后所制备的搅拌型酸羊乳仍然具有较高的营养价值。

2.6 TG浓度对羊乳中蛋白质交联程度的影响

不同TG浓度处理羊乳后，羊乳中主要6种蛋白质相对含量的变化情况见图6。TG处理羊乳后，在40 ℃下保温2 h，灭酶后采用SDS-PAGE电泳分离出的羊乳中6种主要蛋白质，并且采用ChemiDoc-It软件分析各个条带的像素密度，计算TG处理后单个蛋白质的像素密度占未经TG处理样品像素密度的百分比即为单个蛋白质的相对含量。

图6 TG浓度对羊乳中蛋白质相对含量的影响Fig.6 Effect of TG concentration on the relative content of protein in goat milk during the storage period

从图6b分析知，本试验采用的羊乳β-酪蛋白的含量最多，α-酪蛋白的含量较少，κ-酪蛋白的含量最少，这与DOMAGAA[14]报道羊乳αs1-酪蛋白的含量较少一致。由图6a可以看出，通过TG处理羊乳后，羊乳中κ-酪蛋白和α-乳白蛋白的相对含量变化较大，当TG浓度为2 u/g蛋白时，κ-酪蛋白和α-乳白蛋白相对含量分别降低55%和56%，而αs1、αs2、β-酪蛋白和β-乳球蛋白相对几乎无明显变化。表明TG可有效促使κ-酪蛋白和α-乳白蛋白的交联，而对αs1、αs2、β-酪蛋白和β-乳球蛋白无交联作用，HSIEH[30]报道酪蛋白胶束表面的κ-酪蛋白是最容易被TG催化发生交联反应。GAUCHE[31]报道乳清蛋白不易发生交联，但在加热后，α-乳白蛋白变性，增加了TG催化位点，促使交联反应的发生，而β-乳球蛋白具有较稳定的蛋白质球状四级结构，不容易发生交联，本研究中TG处理羊乳后可有效提高搅拌型酸羊乳贮存期间的持水性与其交联程度有关。

3 结论

针对不同浓度的TG处理羊乳后经发酵制得的搅拌型酸羊乳，研究其在贮存期的pH、黏度、持水性、风味物质、乳酸菌的变化情况以及不同TG浓度处理羊乳后乳中蛋白质交联程度的变化。结果表明，TG处理过后制备的搅拌型酸羊乳可显著抑制贮存期间乳酸菌的产酸能力，抑制酸乳中嗜热链球菌的生长活性，而对保加利亚乳杆菌无明显影响；同时TG处理也在一定程度上抑制了酸乳中风味物质的形成，但TG处理可显著提高搅拌型酸羊乳贮存期间的黏度和持水性。SDS-PAGE电泳表明，TG处理羊乳后，羊乳中κ-酪蛋白和α-乳白蛋白明显发生交联，从而提高酸乳的黏度和持水性。总之，羊乳经TG适当处理后，有利于提高搅拌型酸羊乳的品质。

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