人类血小板因子Ⅳ水平与恶性疟原虫感染的关系

谢东德 陈江涛 Urbano Monsuy Eyi Rocio Apicante Matesa Maximo Miko Ondo Obono Carlos Sala Ehapo 李莹 梁雪雁 林敏

1江门市人民医院检验科（广东江门529000）；2广东省援助赤道几内亚医疗队（广州510000）；3惠州市中心医院检验中心（广东惠州516001）；4马拉博地区医院检验科（马拉博，赤道几内亚共和国）；5汕头大学医学院组织胚胎教研室（广东汕头515000）

疟疾是一种由疟原虫感染引起的严重危害人体的全球性疾病，全世界每年约有1亿的临床病例，约110余万人死于该病，其中大部分死亡病例发生在非洲撒哈拉沙漠以南地区［1］。众所周知，与其他的许多感染性疾病一样，自身的遗传因素能够影响人体对于疟疾感染的风险。人类血小板因子Ⅳ（PF4）能够活化血小板，使血小板与红细胞表面的Duffy抗原结合，从而杀伤红细胞里面的疟原虫［2-3］，达到降低宿主脑型疟的风险的作用［4-5］。笔者在参加援非医疗队期间工作于赤道几内亚共和国马拉博地区医院，对许多疑似疟疾患者作过疟原虫检查，同时对部分疟疾患者作过PF4检测，旨在探讨疟原虫感染与PF4的关系。

1 材料与方法

1.1 研究区域 比奥科岛（Bioko Island），原名“费尔南多波岛”（Fernando Poo），是非洲几内亚湾中最大的一个火山岛，属赤道几内亚管辖，隔海与尼日利亚和喀麦隆相望。该岛面积为2 017平方公里，岛上最高点3 012 m，人口约266 000万人，属于潮湿的热带雨林气候，是全球疟疾感染最严重的地区之一。尽管赤道几内亚政府在该岛实施疟疾防治计划（Bioko Island Malaria Control Project，BIMCP），以中国为代表的国际社会派遣医疗队参与了当地的疟疾防控已经取得明显的效果，但疟疾仍然是该岛的一个重大的公共卫生问题。该岛的昆虫学接种率（entomological inoculation rates，EIRs）为163 ～ 830，户外EIRs超过900，超过52%的感染者为5岁以下的儿童［6］。

1.2 研究对象 本研究开展于2012-2014年笔者参与广东省援助赤道几内亚医疗队期间，所有计划获得赤道几内亚马拉博地区医院（Malabo Re⁃gional Hospital）伦理委员会的批准，并同时取得患者/监护人的知情同意。随机抽取2013年雨季（当地疟疾最为严重时间段）门诊患者，按照疟疾的感染情况将研究对象分为两组：（1）疟疾组：马拉博地区医院收治的疟原虫感染者（黑人），共122例，其中男66例，女58例，年龄在2～63岁之间，平均（26.3±5.6）岁；（2）正常对照组：无近期病史的人，共399例，其中男189例，女210例，年龄在2～74岁之间，平均（23.5±4.7）岁。

1.3 样本采集 采用无抗凝剂真空管采集每名收试者静脉血3 mL，同时按照国家行业标准制备薄血膜和厚血膜［7］。其次，将3 mL静脉血静置凝固后，在2 h内采用3 500 r/min的转速离心5 min分离血清，并将血清置于1.5 mL离心管-20℃冷冻保存待用。

1.4 疟原虫检测及虫种鉴定 采用WHO推荐的白细胞疟原虫计数法，在油镜下对吉姆沙染色后血涂片进行镜检［8］；按照本实验室以往建立定量PCR及熔解曲线的方法进行虫种鉴定，同时以四种疟原虫（间日疟原虫，Plasmodium vivax；三日疟原虫，Plasmodium malariae；卵形疟原虫，Plasmodium ovale；恶性疟原虫，Plasmodium falciparum）的标准质粒作为对参照物［9］。

1.5 PF4浓度检测 采用酶联免疫法（ELISA）检测，试剂系美国R&D的人类血小板因子4（PF⁃4/CXCL⁃4）ELISA检测试剂盒，全程严格按照试剂使用说明书进行操作。大致步骤是：（1）分离出患者的血清标本；（2）标准品的稀释与加样及患者标本加样等酶标检测操作；（3）在酶标仪以空白孔调零，450 nm波长依顺序测定各孔的吸光度（OD值）；（4）以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制出标准曲线，根据患者标本的OD值由标准曲线查出相应的PF4浓度；（5）以PF4标准品浓度为0时的OD值为界定值用以确定患者及献血者的PF4水平属于阴性还是阳性，笔者拟定≤0时的OD值为阴性、＞0时的OD值为阳性。PF4浓度单位为μg/L。

1.6 统计学方法 数据的统计分析使用IBM@SPSS Statistics Version 13.0统计软件。用频数分布曲线来检验数据是否符合正态分布，若偏度系数（Skew⁃ness）和峰度系数（Kurtosis）均＜ 1，可认为近似于正态分布；若Skewness和Kurtosis均＞1，即认为数据为非正态分布。非正态分布数据用中位数（P25～P75）来描述。采用两独立样本非参数检验（Mann⁃WhitneyU）比较疟疾组与对照组的PF4水平。用非条件的Logistic回归进行单因素和多因素分析。比值比（OR）和调整OR（AOR）用95%的置信区间表示（95%CI），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疟疾感染情况 所有样本用WHO法和荧光定量PCR⁃熔解曲线分析，发现导致该地区疟疾均是恶性疟原虫，疟原虫密度不符合正态分布：21 335（4 065 ～ 91 800）个/μL，（Skewness=2.755和Kurtosis=8.266均＞1）。如表1所见，年龄是人群的疟疾感染疟疾感染的强烈的相关因素，其中儿童组和少年组的疟疾感染率均高于成人组的感染率，两者与成人组比较，存在统计学差异（P＜0.05，表1）。但不同性别的比较，两者之间不存在统计学差异（P＞0.05）。

表1 不同年龄和性别的疟疾感染风险性评估Tab.1 Risk assessment of malaria infection at different age and sex 例

2.2 疟疾组与对照组PF4均值和PF4阳性率比较 如表2所示，PF4水平在疟疾组与对照组均不符合正态分布，疟疾组略高于对照组，经两独立样本非参数检验（Mann⁃WhitneyU），发现Z=-2.07，P=0.038，两者之间存在统计学差异（P＜0.05）。

根据PF4的参考范围，将疟疾阳性组划分为High组（PF4水平高于正常）和Normal组（PF4水平处于正常范围）。我们发现，两组的疟原虫密度基本处于同一范围，结果如图1所示，两者之间无存在统计学差异（P=0.657）。

表2 2组PF4均值和PF4阳性率比较Tab.2 Comparison of PF4 mean and PF4 positive rate between 2 groups

图1 PF4水平和疟原虫密度图Fig.1 PF4 levels and Plasmodium density maps

3 讨论

在非洲许多国家，疟疾被称为“头号杀手”［10］。赤道几内亚共和国位于非洲中西部，是全球50个最不发达国家之一，属热带雨林气候，国家的卫生和经济条件差，为疟疾的高发区，其中儿童疟疾占相当大比例，而儿童疟疾病例以恶性疟原虫感染为主，尤其是＜5岁儿童感染疟疾的死亡率高［11］。由于大部分抗疟药物逐渐出现的耐药性以及开发有效疫苗是一个长期过程，因此研究疟疾的发病机制以及宿主对感染作出的反应显得尤为紧迫。

血浆PF4增高表示血小板被激活及其释放反应亢进，常见于血栓前状态和血栓栓塞性疾病。因此，卢亚敏等［12］研究揭示冠心病患者PF4水平较正常组升高，胆固醇水平可能通过影响PF4的水平促进冠心病的发生，且与冠心病病情程度相关。MCMORRAN等［2］认为PF4激活血小板后，可使血小板与红细胞表面的Duffy抗原相结合，通过结合感染的细胞及杀死其内部的寄生虫来限制红细胞内的疟原虫的繁殖。最近很多研究也显示PF4、红细胞表达的Duffy抗原、抗疟素因子在血小板杀死疟原虫能力中发挥重要作用［13］。与1983年Essien EM和Ebhota MI在尼日利亚的研究一致［14］，本研究发现，疟疾组的PF4水平明显高于对照组（P＜0.05），揭示人体感染疟原虫后，血液中的PF4水平可应激性升高，通过与感染的红细胞结合来杀死其内的疟原虫。而PF4和红细胞Duffy抗原受体（Fy）结合是血小板杀死疟原虫的关键。PF4与感染的红细胞接触后，必须依赖与之结合的Fy受体，定位于红细胞内疟原虫的消化泡（DV）并导致细胞器的特定溶解和疟原虫的死亡，由此可见PF4是一个独特的例子，它是一种由宿主衍生能直接杀灭原虫的趋化因子。但令人困惑的是，我们的实验未发现PF4高水平组和正常水平组之间的恶性疟原虫密度的存在差异，可能与受感染红细胞表达的Duffy抗原受体（Fy）的数量有关，PF4与Fy复合物如何定位疟原虫以及进入疟原虫的复杂分子机制亦还有待证明。由于未有更详细的相关研究报道，这有待于我们去一进步扩大标本的数量，以期找到一个更有说服力的结果。

该研究的目的是为了了解血小板介导的疟原虫杀灭机制，为疟疾治疗提供思路。前人的研究已经发现血小板在抵抗疟原虫过程中起到了一定的作用，本次研究拓展了前人的研究，进一步探索PF4和Fy等关键物质在该过程中发挥的作用。

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