三峡库区常见豆科植物对铬污染生理响应的FTIR研究

李 新，刘正学，余顺慧*，张 静，包欣月，何昕航

(1.重庆三峡学院 环境与化学工程学院，重庆 万州 404100；2.重庆市万州第二高级中学，重庆 万州 404100；3.重庆信息技术职业学院，重庆 万州 404100)

【研究意义】随着现代工业的发展，环境中的重金属总量显著增加，大量重金属被广泛的分布于大气、水体、土壤、生物体中。重金属污染主要包括：铅(Pb)污染、镉(Cd)污染、汞(Hg)污染、铬(Cr)污染、铜(Cu)污染、镍(Ni)污染、锌(Zn)污染等。其中，铬(Cr)作为“七大元素”之一，具有明显的“三致”作用，土壤Cr污染己对农业生产和人类健康造成了严重的威胁[1]，是典型的环境污染物之一。三峡库区生态屏障区作为重点的生态环境治理区域，其区域内的土壤重金属污染改如何处理，以及如何有效筛选耐重金属农作物，在保障移民经济收入的同时，改善库区土壤生态安全，在当前具有十分重要的实践意义。【前人研究进展】植物修复技术作为当前理土壤重金属污染的重要技术之一，其修复核心是筛选耐重金属富集的植物。各国环境科学工作者在筛选耐铬植物方面做了大量工作。如发现了超积累植物李氏禾，以及具有修复潜力的植物如：芦竹和农作物芥菜型油菜四川黄籽等。李氏禾适用于修复被铬污染的人工湿地，但其余几种植物用于修复铬污染的土壤，还没有大规模的应用。豆科植物黄豆(Glycinemax)及绿豆(Phaseolusradiatus)是我国三峡库区生态屏障区常见的一年生农作物，具有生长快，生物量大，固氮，不用施肥、适应性和抗逆性强等特点。用豆科植物作为对重金属污染地修复的先锋植物的可能性研究在国际上成为一个新的热点。傅立叶红外光谱(FTIR)是一种基于化合物中官能团和极性键振动的结构分析技术，其特点是灵敏度高、快速及操作简单等[2]。FTIR能够提供生物大分子特定的振动吸收普带，从而敏锐地测定这些分子的相对含量以及构象等变化的信息，现在已经被应用于许多研究领域。目前,报道较多的是用于植物对重金属的耐性机制研究[3-4]。而对修复土壤重金属污染的豆科植物各组分进行FTIR的研究鲜有报道。【本研究切入点】本实验选对土壤污染较大的常见重金属铬为实验对象，以其不同浓度处理绿豆幼苗，利用FTIR研究植物各组分官能团的变化, 探讨其对重金属的吸附性和耐受性,同时研究及植物对铬富集效应。【拟解决的关键问题】以期为利用绿色生态修复技术控制土壤污染、改善土壤环境提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用水培方法，选取生长一致的绿豆幼苗，其根系先后用自来水、去离子水洗净，移栽到200 mL广口瓶中进行水培(用自来水)，每个广口瓶内移栽30株绿豆幼苗。Cr6+以K2Cr2O7形式加入，Cr6+浓度分别为0、5、10、50、100 mg/L，每个浓度处理3个平行。所有处理溶液的pH值保持在(6.5±0.1)，并保持 24 h 连续通气。处理 11 d 后，收获绿豆幼苗植株。用自来水和去离子水洗净，分离根、茎、叶，在105 ℃烘箱杀青 30 min，然后于80 ℃烘箱中干燥 48 h。剪碎，置于磨砂研钵内研磨至粗细均匀的粉末，过200目筛[5]。

1.2 傅里叶红外光谱(FTIR)分析

傅立叶红外光谱仪(日本岛津制造IRPrestige-21，光谱范围4000～400 cm-1，分辨率16 cm-1，测定黄豆根、茎、叶组织样品的光谱信息。

1.3 微波消解样品测定其重金属Cr6+含量

精确称取各样品0.2000 g，加入酸液(浓HNO3∶浓H2SO4=4∶1)，同时做空白组；将以上溶液在MARS240微波消解系统消解后，冷却、过滤。滤液在25 mL容量瓶中定容，移入塑料瓶中保存，用AA-6300原子吸收分光光度计测定样品中Cr6+含量(mg/kg干重)[5]。

1.4 数据分析

实验数据采用SPSS11.5进行统计分析和处理，根据绿豆幼苗吸收峰的吸光度值的特点筛选出多个比较典型的吸收峰,并记录不同波数的吸光度。原始数据采用ORIGIN 7.0 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度铬处理对绿豆幼苗生长的影响

图1 不同浓度铬处理对绿豆生物量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of Cr on the biomass of Phaseolus radiatus L.

如图1所示，随着Cr6+处理浓度的增加，绿豆根、茎、叶的生物量呈现出先增后减的趋势。但不同铬处理条件下绿豆都能生长正常(能完成植物的生长发育过程)，不同铬处理条件下生物量差异不显著(P>0.05)。这表明绿豆对铬有较强的耐性。铬不是是植物生长发育所必需的微量营养元素[6]，但低浓度的Cr6+会促进植物的生长，但高浓度的Cr6+会抑制植物的生长。然而，受植物遗传学特性、生态学特性等因素所决定，不同植物对Cr6+污染的忍耐性是不同的。因此，对植物生长有利的铬浓度范围要根据植物的种类而定[7]。有研究表明随着Cr6+处理的增加时抑制紫花苜蓿、高羊茅、白花三叶草的生长[8]。研究表明，在Cr6+处理浓度<10 mg/L时促进绿豆生长，而Cr6+处理浓度>10 mg/L时抑制绿豆的生长，高浓度铬(100 mg/L)处。从形态上观察，高浓度Cr6+胁迫后植株表现矮小，上胚轴弯曲，根部出现发黑，叶稍微卷曲的特征[9]，这可能是因为在高浓度铬处理条件下绿豆幼苗对铬污染的一种生理响应。

2.2 不同浓度铬处理对绿豆幼苗的FTIR分析

a: Control; b: 5 mg/L; c: 10 mg/L;d:50 mg/L; e: 100 mg/L图2 不同浓度Cr6+处理下绿豆幼苗根的傅里叶红外光谱图(400～4000 cm-1)Fig.2 Absorption FTIR spectra in the roots of P. radiatus L. under different concentrations of Cr6+

图3 不同浓度Cr6+处理下绿豆幼苗茎的傅里叶红外光谱图(400～4000 cm-1)Fig.3 Absorption FTIR spectra in the stems of P. radiatus L. under different concentrations of Cr6+

应用FTIR 对绿豆幼苗的根、茎、叶测定分别得到红外光谱图(图2～4)。3217～3278 cm-1处的谱带是典型的缔合OH伸缩振动吸收峰以及蛋白质、氨基酸、核酸、维生素等物质中N-H键的伸缩振动吸收的叠加，主要反映植物所含蛋白质、核酸等在光谱中的贡献[10-12]，2924～2934 cm-1附近是甲基伸缩振动[13]，主要来自于各种膜及细胞壁及维生素等成分。1610～1655 cm-1附近是N-H酰胺的弯曲振动峰，其中1645 cm-1左右的峰值为酰胺化合物的吸收Ⅰ带(包括 %-CONH-中的C= O 伸缩振动)[12, 14]，是蛋白质的特征红外光谱。1411～1453 cm-1处是羧酸根离子(COO-)的特征吸收峰, 是由于羧酸中C-O伸缩振动引起的，主要来自于果胶质等成分[12]。1355～1366 cm-1处是含油脂化合物(各种膜和细胞壁)的组织中甲基C-H的变形振动峰[15-16]。1054～1064 cm-1附近是醇、酯基、醚基或酚类等化合物C-O键的伸缩振动吸收峰[17]。

图4 不同浓度Cr6+处理下绿豆幼苗叶的傅里叶红外光谱图(400～4000 cm-1)Fig.4 Absorption FTIR spectra in the leaves of P. radiatus L. under different concentrations of Cr6+

表1 不同浓度Cr6+处理下绿豆幼苗的特征峰变化

对不同浓度重金属处理前后的绿豆幼苗的根、茎、叶进行了红外光谱分析，结果显示各组分在重金属处理前后的峰形基本保持不变，只有某些参与重金属吸附的官能团的吸收峰发生了不同程度的位移，没有参与重金属吸附的官能团的吸收峰位移均较小[12]，如2924～2934，1054～1064 cm-1等的吸收带。变化较明显的有羟基(3217～3278 cm-1)、羧基(1411～1453 cm-1)、酰胺基(1610～1655 cm-1)等的吸收峰。原因可能是植物吸收重金属后，羧基与重金属发生了离子交换或络合，最大吸收峰波数略有降低；酰胺峰是蛋白质的特征谱带，在后，羧基与重金属发生了离子交换或络合，最大吸收峰波数略有降低；酰胺峰是蛋白质的特征谱带，在附重金属后，其吸收峰的位置和强度发生了变化[12]，表明在吸附过程中蛋白质作为运输重金属离子的载体或与其螯合的大分子物质起到了重要作用[18-19]。植物对重金属胁迫的反应表现于生理特征上，而核酸、碳水化合物等有机物特征峰的变化可反映植物在重金属污染下的生理情况，耐重金属毒害的植物与重金属敏感型植物在重金属耐性上的差异主要也是由于其体内生理生化代谢存在着差异的缘故[19-20]。

由表1可知，绿豆幼苗根、茎、叶红外光谱特征峰的吸收强度随重金属浓度的增加表现趋势有所不同。根在高浓度重金属处理后大多数特征峰都比对照低，在同一浓度同一特征峰下根的吸收强度也比茎、叶低，这可能是因为将有害离子积累于根部是植物阻止其对光合作用及新陈代谢活性毒害的一种策略[10,19]，或是根的向上运输作用。在3217～3278，1610～1655，1411 ～1453 cm-1等处，绿豆幼苗根吸收峰的吸光度表现为高浓度比中低浓度高，说明高浓度的重金属可诱导它产生大量的蛋白质、氨基酸等物质，通过渗透调节来增强抗逆性,提供氮源，减轻重金属毒害[18]，稳定内部环境。在重金属处理后，绿豆幼苗茎、叶的特征峰都比对照高或接近于对照。这可能是由于绿豆幼苗对重金属的耐性高的缘故[18]。

2.3 Cr6+胁迫对绿豆幼苗中重金属分布的影响

由表2可知，随着Cr6+浓度的增大该植物地上部分根、地下部分的Cr6+积累量增加，各处理间差异显著(P<0.05)，其具体表现为地下部分根>地上部分。并且浓度越大，增长的幅度也越大，积累的量越大。地上部分(茎、叶)积累Cr6+的量明显低于根部，说明根部所积累的Cr6+只有部分转移到了地上部分。当处理Cr6+浓度为100 mg/L时，此时该植物呈现出明显伤害症状，其积累Cr6+含量仍然最高。根、茎、叶中Cr含量(mg/kg)分别是：3518.34±2.59a，903.99±5.52a，994.08±5.13a。

3 结 论

表2 Cr6+胁迫对绿豆幼苗中重金属分布

注：同列具有不同字母上标者为差异显著(P< 0.05)。

Note： Different letters superscript in same column indicate the significant difference at 0.05 level.

(1)不同浓度铬处理条件下(铬浓度低于100 mg/L) ，绿豆幼苗均能正常生长，虽然在100 mg/L铬处理件下，生物量又略显降低，但是生物量在不同处理条件下差异不显著，这表明绿豆幼苗具有较强的铬耐性。

(2)重金属并未破坏植物器官本身的结构，是因为绿豆幼苗根、茎、叶各组分在重金属处理前后的红外光谱峰形基本保持不变，而发生较大位移的吸收峰(3217～3278，1411～1453，1610～1655 cm-1)与参加重金属吸附的官能团有关，这说明作为运输重金属离子的载体及与其螯合的大分子物质与重金属发生了离子交换、络合。

(3)植物体内生理与代谢变化与绿豆幼苗红外光谱有机物特征峰的变化有关，根随重金属浓度增加而降低反映核酸、碳水化合物等有机物变化的特征峰的吸收强度。而植物茎、叶对重金属有较强的耐性，因为它们在各浓度重金属处理下与植物生理有关的化学成分的特征峰大多数都比对照高或接近于对照。

(4)很多重金属元素能够积累在植物体内，绿豆幼苗对Cr6+的积累地上部分(茎、叶)积累的Cr6+量明显低于根部，因此，根是最容易受Cr6+毒性影响的部位，根部Cr6+含量的变化是植物受Cr6+毒性影响的重要指标之一。

(5)虽然绿豆不是 Cr6+的超积累植物，但从耐Cr6+能力、地上部分对Cr6+的富集量等多方面综合考虑，绿豆幼苗受Cr6+污染的土壤中植物修复技术领域，拥有潜在的利用价值。

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