喀斯特有机烟区不同施肥模式对烟叶化学成分的影响及其与土壤微生物性质的关系

毛君杰，肖谋良，陈香碧，梁承明，董明哲，苏以荣，李巧云，申 燕

(1.湖南农业大学生物科学技术学院,湖南 长沙 410128；2. 中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙 410125； 3. 贵州省烟草公司毕节市公司，贵州 毕节 551700)

【研究意义】我国喀斯特地貌主要分布在贵州、广西、云南三省，面积约55万km2[1]。该区域海拔较高、气候温和、日照充足、降雨量丰沛，是我国优质烤烟主产区。烤烟是我国喀斯特贫困地区最重要的经济作物之一[2]。近年来，采用有机生产方式生产烤烟的技术在喀斯特地区得到大力推广，深受国内外卷烟工业企业的青睐，其发展势头势不可挡[3]。然而，喀斯特地区烤烟不同有机生产方式下，烟叶质量和土壤性质有何差异尚不清楚。【前人研究进展】施肥是烤烟栽培的关键技术之一，肥料种类、施肥用量和施肥方法对烟叶品质和土壤性质都具有显著的影响[4-5]。施用适量腐殖酸肥和芝麻饼肥可提高土壤微生物总量，促进烤烟根系发育，协调烟叶化学成分，增加烟叶产量，从而提高烤烟产值[6]。施用菜籽饼和花生饼肥后土壤中细菌、放线菌、好气性纤维分解菌和亚硝化细菌数量明显增加[7]。我国酿酒业发展十分迅速，每年都要产生大量的下脚料——酒糟，除少量用作饲料外，大部分尚未得到合理利用。研究发现，以酒糟为原料发酵有机肥的含氮量达3 %，含磷量1 %，有机质含量超过70 %，各项指标均符合国家标准[8]。此外，酒糟中含有丰富的蛋白质和氨基酸等有机养分，能增加土壤中水解性氮含量，提高氮肥利用率，促进烟苗早期生长发育。而针对酒糟作为有机肥施用于烟田土壤的研究尚不多。【本研究切入点】目前，贵州喀斯特山区烤烟生产以烟草专用有机肥和农家肥为主，其成本较高且资源日益匮乏。另一方面，贵州省白酒产业发达，产生大量的有机副产物——酒糟。若能合理利用这些有机废弃物资源逐步取代烟草专用肥和农家肥对于降低烤烟生产成本、实现喀斯特地区有机方式生产烤烟的可持续发展具有重要意义。【拟解决的关键问题】本试验利用喀斯特烟区现有有机废弃物资源——酒糟作为烤烟有机肥源替代品种，研究适合当地烤烟生长的施用配方并探讨其对烤烟主要化学成分和土壤微生物群落结构的影响，对降低烤烟种植成本、提高其经济效益有重要现实意义。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于贵州省毕节市金沙县，地处中国西南喀斯特山区，海拔1100～1400 m。金沙县地跨东经105°47′～106°44′，北纬27°07′～27°46′，年均气温在12.5～16.5 ℃，昼夜温差大，年均降雨量为1050 mm，年日照数平均1098 h。县域内植烟区的土壤类型主要为黄壤、石灰土、粗骨土、紫色土和潮土。本研究供试土壤主要为黄壤，pH 6.1，土壤有机质和全氮含量分别为30.17和1.49 g/kg。

1.2 试验设计

于2014年3月在金沙县桂花站开化点选择开阔、平坦、向阳的土地一块，土壤类型一致，面积约2000 m2，进行小区试验。试验区统一采用单行起垄盖膜方式，共10个处理(加上对照)，每个处理小区约32.4 m2，4个重复。每个重复3行，每行种植烟苗15株，共45株。株距0.6 m，垄距1.1 m，垄底宽0.7～0.8 m，垄体土碎平整饱满。不同处理间间距1.8 m，重复间间距2.2 m，并挖沟间隔。供试烤烟品种为云烟87。试验以当地有机烟施肥模式(T1)为对照，共设置9个以酒糟配合两种微生物肥料逐步取代农家肥和商品有机肥的处理(T2～T10)，每处理4个重复，具体施肥量详见表1。设置处理的原则是以当地习惯施肥135.5～135 kgN/hm2为依据，各处理间氮肥施用量基本保持一致。试验所用酒糟有机肥以当地酿酒厂生产过程中产生的发酵废渣(主要成分为高粱发酵物)为原料，经接菌(解淀粉芽孢杆菌和莫海威芽孢杆菌)、掺拌、条垛堆积与自然通风后，再进行粉碎、过筛(20目)所得。本试验选取时科竹炭与沃土沃两种微生物肥料进行施用。施用微生物肥料目的是促进酒糟中有机质降解，加速养分释放。其中，时科竹炭生物有机肥产自时科生物科技(上海)有限公司，以竹炭、竹醋液、氨基酸、腐植酸、有益微生物菌群等为主要原料。沃土沃微生物肥料产自焦作市宗源生态产业有限公司，以NX-PGPR复合微生物菌为核心(中国农业科学院土壤肥料研究所研发)，由多种营养菌、生物拮抗菌组成。试验所用农家肥中氮、磷、钾含量分别为5.86、1.80、6.42 g/kg，商品有机肥中氮、磷、钾含量分别为36.00、11.87、21.51 g/kg，油枯中氮、磷、钾含量分别为54.94、26.02、11.49 g/kg。酒糟中氮、磷、钾含量分别为21.00、0.31、1.90 g/kg。

在经过深耕、耙平的烟地上设置试验小区，于移植烟苗前两周施用基肥。随后单行起垄盖膜，并选取壮苗移栽。小区严格按当地有机烟管理方式进行，同时做大田管理及其它生产有关情况的记录。

表1 各处理肥料用量

1.3 样品采集

于2014年7月中旬与中下旬烤烟成熟期，分别采集每个小区5株烟草的下部叶及上部叶，并将同一小区同一部位烟叶混合。每个样品取1.50 kg，于105 ℃下杀青15 min后，60 ℃烘干至恒重，粉碎过60目筛，用于烟叶化学成分测定。每批烟叶采样至杀青的间隔时间应尽量一致。此外，在每个小区采用多点采样法采集表层土壤(0～15 cm)，混匀后分为3份。第1份约50 g置于冰盒中带回实验室冷冻干燥后用于微生物数量和群落结构分析；第2份约300 g带回实验室后过2 mm筛，用于微生物生物量测定；第3份约500 g经自然晾干、除去植物根系、石砾后，过筛用于分析土壤基本性质。

1.4 分析方法

1.4.1 烟叶化学成分 分别依据《中华人民共和国烟草行业标准》YC/T 159-2002、YC/T 161-2002、YC/T 160-2002、YC/T 173-2003和YC/T 162-2002的连续流动分析法测定烤烟总糖与还原糖、总氮、烟碱、钾及氯含量。

1.4.2 土壤微生物量碳氮和基本理化指标 采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法测定土壤微生物量碳和微生物量氮[9]；其它土壤理化指标参照《土壤农化分析》相关方法测定[10]。

1.4.3 土壤微生物群落分析 微生物总DNA提取：采用SDS-GITC-PEG法提取土壤微生物总DNA[11]，用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小，用核酸蛋白测定仪检测DNA的浓度与质量。实时荧光定量PCR：以细菌通用引物F984和R1378[12]和真菌通用引物NS1/Fung[13]，根据SYBR Premix ExTaq(Perfect Real Time)产品说明进行细菌和真菌的定量PCR扩增。构建克隆文库：以土壤微生物总DNA为模板，分别对细菌16S rDNA(引物为：27F和519R)[14]、真菌18 rDNA(引物为：ITS1F和ITS4)基因片段进行PCR扩增[15]。回收目的片段进行克隆，并送华大基因进行测序。

1.5 数据分析方法

各克隆库中的序列输入EMBL-EBI网站进行比对，根据相似性95 %归为一个操作单元(OTU，等同于“属”分类)，采用Estimate S Win9.1.0软件和Excel 2010计算香农多样性指数、辛普森指数和均匀度指数并绘制稀疏曲线；将序列输入Ribosomal Database Project 11.3数据库中，按相似性为80 %分别确定纲和门的遗传分类[16]。

采用SPSS 19.0软件，对烟叶化学成分进行单因素方差分析(置信水平95 %，99 %)。

2 结果与分析

2.1 烟叶化学成分

表2 不同处理上部和下部烟叶的主要化学成分含量

注：UP代表上部叶，LO代表下部叶；同列不同字母表示该指标在不同处理间差异显著(P<0.05)。

Notes：UP represents upper tobacco leaves, LO represents lower tobacco leaves; Various letters in the same column represent significant difference (P<0.05).

本研究根据袁有波等[17]结合工业企业对烟叶化学质量的要求和毕节各区县历史烟叶质量状况制订的评价指标体系，分析本研究不同处理烟叶化学成分(表2)。烟碱：所有处理的烤烟上部叶和下部叶烟碱平均含量分别为4.10 %、2.51 %，总体处于较高或高水平；当地施肥处理T1的上部叶和下部叶烟碱含量均处于高水平，与其相比，除优化施肥处理T2、T6和T10的上部叶烟碱含量略有升高(P>0.05)以外，其余处理的上部叶和下部叶烟碱含量均降低(降幅0.00 %～0.60 %)，部分处理达到显著水平(P<0.05)。总糖：所有处理的总糖处于适中或较高水平；与T1相比，所有优化施肥处理的上部叶总糖含量均降低(降幅0.67 %～5.91 %)，其中T10达到显著水平(P<0.05)；所有处理的下部叶总糖含量无显著差异(P>0.05)，降低后的总糖含量更趋近于适中水平。还原糖：所有处理上部叶和下部叶还原糖平均含量分别为24.16 %和31.87 %，处于较高水平；与T1相比，优化施肥处理上部叶还原糖均有所降低(降幅0.24 %～5.46 %，P>0.05)，其中T10达显著水平(P<0.05)，下部叶除T3、T3和T4处理略微升高外(P>0.05)，其余处理均降低(降幅0.15 %～1.82 %)。总氮：T1的上部叶氮素含量偏低，优化施肥后，各处理氮素含量均有上升，增加量在0.06 %～0.30 %；除T4外，下部叶全氮含量均处于适中水平(1.63 %～1.87 %)。钾素：所有处理钾素含量在上部叶(0.98 %～1.22 %)和下部叶(1.52 %～1.83 %)均处于低或较低水平；与T1相比，优化施肥处理无显著差异(P>0.05)。氯：所有处理的烟叶中氯含量均处于适中水平(0.35 %～0.51 %)。

总的来说，酒糟部分替代或完全替代农家肥、商品有机肥时，配施微生物肥在一定程度上能降低烟叶烟碱、总糖、还原糖、氯含量，小幅度增加烟叶氮素含量，但对钾素影响不大，使烟叶化学成分处于较适中水平，其中，T3、T5、T8和T10效果较好，T4、T7和T9效果次之，T2和T6效果欠佳，其会造成烟碱小幅升高或钾素小幅降低。

2.2 烟田土壤养分

烤烟成熟期，所有处理烟田土壤基本性质(表3)中pH无显著差异(P>0.05)。与对照T1相比，酒糟部分替代商品有机肥并且添加微生物肥料加微生物肥料时(T2、T5和T6)，有利于土壤有机质的积累、并提高土壤全氮、速效氮、全钾、速效钾、速效磷含量，利于有机肥中速效养分的释放。

表3 烟草成熟期土壤基本性质

表4 不同施肥处理下烟田土壤细菌和真菌丰度

注：同一列不同阿拉伯字母表示某指标在不同处理间差异显著(P<0.05)。

Note： Various letters in the same column represent significant difference (P<0.05).

2.3 烟田土壤微生物丰度和多样性

总体上，各处理土壤细菌(2.96×1010～4.61×1010)比真菌数量(1.04×107～3.62×107)高约3个数量级(表4)。随着酒糟肥逐步取代商品有机肥和农家肥，土壤中细菌和真菌数量均上升，且总体以酒糟肥完全取代商品有机肥和并配合施用沃土沃或时科竹炭微生物肥的数量最高。基于土壤中细菌数量远大于真菌，我们仅对细菌群落结构进行分析。结果显示：细菌多样性指数以优化施肥处理(T3～T9)略高于当地施肥处理(T1)，其中T3的细菌多样性略高于其余2个处理，而T5和T8显著高于未添加微生物肥的处理。

2.4 烟田土壤细菌群落结构

10个克隆库共2000个克隆子被归类为16个类群(门)，其中变形菌占19.0 %，放线菌占16.5 %，酸杆菌占14.1 %，绿弯菌占13.7 %，这四类作为优势类群合计占克隆库的63.2 %(图1)。

对四类优势菌分别进行具体分析。变形菌：当地施肥(T1)条件下，变形菌占19 %，与其相比，50 kg酒糟取代20 kg商品有机肥的处理(T2、T3、T4)变形菌均显著下降；当150 kg酒糟取代200 kg农家肥和40 kg商品有机肥并配施沃土沃微生物肥(T6)后变形菌比例显著增加至30 %，其余2个处理(T5和T7)变化不大；当250 kg酒糟全部取代农家肥和商品有机肥并配施沃土沃或时科竹炭微生物肥(T8和T9)的变形菌比例有一定幅度上升，未配施微生物肥的处理(T10)其比例有一定下降(图1)；不同处理下，变形菌的四个亚门比例总体以α-变形菌所占比例最高，且不同处理之间差异较大(4 %～15 %)，β-、γ-和δ-变形菌所占克隆库的比例，在不同处理间差异不大(数据未列出)。放线菌：当地施肥处理(T1)的放线菌门占10.5 %，优化施肥处理后，该类细菌所占比例均有明显提高(14.5 %～20 %)。酸杆菌：当地施肥处理(T1)的酸杆菌门占17 %，优化施肥处理中，除150 kg酒糟取代200 kg农家肥和40 kg商品有机肥并配施沃土沃微生物肥的处理(T5)其比例有一定升高(19.5 %)外，其余优化施肥处理均不同程度下降(16 %～10.5 %)；酸杆菌以Gp4和Gp6 2个类群为主)。绿弯菌：当地施肥处理(T1)的绿弯菌占13 %，施用沃土沃微生物肥的处理T5和T8的绿弯菌比例下降外，其余处理均有一定幅度上升。

图1 不同施肥处理下土壤细菌各类群的分布Fig.1 Distribution of bacterial phyla under different fertilization treatments

除四类优势类群外，克隆库还存在拟杆菌、疣微菌、芽单胞菌等非优势类群，其中未知菌占克隆库的12.8 %。

3 讨 论

烟碱、总糖、还原糖、总氮、钾、氯等化学成分的绝对含量和比例是评价烤烟品质最主要的指标[18]。本小区试验表明，无论是该烟区原有的施肥模式还是优化施肥模式下，烤烟烟叶烟碱、总糖、还原糖、总氮、钾、氯含量均处于适宜至偏低或偏高的范围内，即该烟区烟叶质量总体较好。本研究采用低廉且易获得的酒糟肥配合少量微生物肥替代价格相对高昂的烟草专用有机肥以及当地日渐匮乏的农家肥后，大部分处理能在一定程度上改善烟叶化学成分的比例，提高烤烟质量。总体上，当酒糟部分取代烟草专用有机肥和农家肥时，需配施少量沃土沃或时科竹炭微生物肥，而当酒糟全部取代烟草专用有机肥和农家肥时则可以不用配施微生物肥。推测其可能的原因是：所用的酒糟肥是利用当地酿酒厂生产过程中产生的发酵废渣(主要成分为高粱发酵物)，经物料接菌、掺拌、条垛堆积发酵和发酵结束后再自然通风1～2个月发酵而成。该肥料中含有大量能分解酒糟有机肥的微生物，当其部分取代烟草专用有机肥和农家肥时，还需要补充一定微生物群落，才有利于烟草专用有机肥中养分的释放。该推论可以从土壤微生物多样性指标得到证实。

一个稳定健康的土壤生态系统依赖于一定的微生物多样性和群落结构。与当地施肥(T1)相比，所有优化施肥处理(T2处理真菌除外)的细菌和真菌数量均显著增加(P<0.05)。而土壤细菌和真菌数量并不总以施用了微生物肥料的处理最高，可能的原因是①酒糟肥、微生物肥、农家肥以及土壤本身的微生物群落之间有拮抗作用；②施用肥料后，外源微生物在作物根际产生系列生物化学作用，刺激作物根系产生抑制微生物生长的物质[19]。

本研究烟田土壤中细菌比真菌数量高约3个数量级，表明细菌占绝对优势。一般而言，变形菌是农田生态系统土壤中的优势细菌类群，尤其在喀斯特农田生态系统中[20]。变形菌门中包含大量维持农田生态系统功能的有益微生物，如α-变形细菌中的根瘤菌具有固氮功能，而α-变形细菌中的根瘤菌目和红螺菌目，β-变形细菌的伯克氏菌目、红环菌目和亚硝化单胞菌目以及γ-变形菌中的着色菌目中部分光合细菌和化能自养菌含有完整的RubisCO I的编码基因，可以通过卡尔文途径来固定二氧化碳，增加土壤碳库[21]。放线菌属于原核生物系统进化树上高GC比例、革兰氏阳性细菌分支类群，它不仅可以降解大量不同类型的有机化合物如有机肥，而且还能分泌各种代谢物质如抗生素及其它拮抗物质，可以杀灭或抑制其它微生物的生长[22]。绿弯菌，它们是一类具有绿色的色素，能通过光合作用产生能量的细菌，绿弯菌主要是利用3-羟基丙酸途径来固定二氧化碳[23]。本研究当地施肥处理的细菌群落以变形菌和酸杆菌门占优势，绿弯菌和放线菌门占次要优势地位，与其相比，优化施肥处理的细菌群落结构趋势基本一致。其中，酒糟肥部分取代烟草专用有机肥和农家肥后以变形菌或放线菌占优势地位；当其配施时科竹炭微生物肥后酸杆菌比例小幅上升，绿弯菌比例小幅下降；当其配施沃土沃微生物肥后变形菌门比例上升(T6处理上升幅度较大)，绿弯菌比例小幅下降。酒糟肥完全取代烟草专用有机肥和农家肥后，土壤细菌以变形菌和放线菌门占绝对优势，其配施微生物肥后变形菌、放线菌比例小幅上升，绿弯菌小幅下降。因此，从优势细菌群落来看，优化施肥能维持原有土壤优势细菌群落和多样性，表明优化施肥后能较好地维持烟田土壤的生态功能，并在此基础上对新的施肥模式有小幅响应(非优势细菌群落小幅改变)，在土壤中形成优化的细菌群落结构。土壤中细菌80 %以上栖息在土壤稳定团聚体微孔中，土壤团聚体的形成是一个长期的过程，施用有机肥对土壤团聚体结构、肥料以及其它水气热等物理性质的改变也是一个长期的过程。

4 结 论

该烟区当地原有施肥模式和优化施肥模式下，烤烟烟叶烟碱、总糖、还原糖、总氮、钾、氯含量均处于适宜至偏低或偏高的范围内。大部分优化施肥处理能在一定程度上改善烟叶化学成分的比例，提高烤烟质量，且优化施肥处理后，土壤微生物优势群落结构和多样性能保持稳定，维持其原有的生态功能。这表明采用低廉且易获得的酒糟肥配合少量微生物肥替代价格相对高昂的烟草专用有机肥以及当地日渐匮乏的农家肥是可行的。该烟区烟叶烟碱偏高、钾素偏低的情况尚未彻底解决，其原因可能在于该烟区施肥量偏高，土壤后期供肥过高，有待进一步优化该烟区施肥水平。

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