“库”对可溶性糖及碳氮代谢相关酶基因表达影响

潘 冬，张玉磊，同拉嘎，李明月，李 丹，韩云飞，王海微，张忠臣，金正勋

(东北农业大学农学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

【研究意义】可溶性糖是重要的非结构性碳水化合物(non-structural carbohydrate, NSC)，主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖等大分子糖类，不仅是高等植物的主要光合产物，而且还是植物体内碳水化合物转化、输运、储藏和再利用的主要形式。可溶性总糖、蔗糖和淀粉三者之间的关系可以互相转化，可溶性糖可作为淀粉合成的底物转化成淀粉，其含量的多少对籽粒淀粉的积累、细胞壁的合成及呼吸基质均具有重要的作用，具体的转化过程更多地依赖于籽粒库对代谢产物的合成及转化能力。可溶性糖含量的变化与水稻功能叶片光合作用能力有密切相关[1]。孕穗期又是碳氮代谢旺盛的时期，可溶性糖是光合作用暗反应的主要产物[2]。因此，协调可溶性糖的积累与再分配利用很有可能为水稻提高产量和秸秆循环再利用提供新的途径。【前人研究进展】RuBP羧化酶是光合作用的关键酶，该酶的活性和含量是评判植物光合能力的重要指标。水稻中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是由1个大亚基和5个小亚基组成的8聚体，OsRBCS1在水稻叶片中不表达。蔗糖是植物光合作用的初产物，通过韧皮部以源库两端的渗透压为驱动力运输到库端，在相关酶的催化下分解、重新合成和代谢[3]。已有研究表明，蔗糖磷酸合酶(sucrose phosphate synthase, SPS)、蔗糖合酶(sucrose synthase, SuS)、酸性转化酶(acid invertase, AI) 是调节水稻CO2同化和蔗糖合成的关键酶[4]。谷氨酰胺合成酶(GS)是无机氮转化为有机氮的第一步，对无机氮素的同化起到关键性的作用。水稻产量的形成主要是淀粉和蛋白质合成与积累的过程[5]，十分复杂的碳氮代谢参与这些过程。因而，研究碳氮代谢过程中上述关键酶活性及基因的表达量对阐明产量形成机理和可溶性糖积累有着重要的理论和实践指导意义。【本研究切入点】本试验选用寒地粳稻穗重型超级稻品种‘松粳9号’和穗数型高产品种‘龙稻11号’，对植株可溶性糖积累特性、剑叶中蔗糖代谢酶活性及碳氮代谢关键酶基因表达量等进行比较分析。【拟解决的关键问题】旨在为阐明水稻产量形成的分子机理和提高秸秆循环再利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验方法

选用寒地穗重型超级稻品种‘松粳9号’和穗数型高产品种‘龙稻11号’，于2015年在哈尔滨东北农业大学校内进行盆栽试验，盆规格为直径30 cm，高35 cm。4月2日播种，大棚盘育苗，单粒等距离点播催芽籽，旱育秧管理，5月10日选取长势一致的秧苗等距离插秧，每盆插1穴，每穴插2颗，每个品种插24盆，正常水肥管理。

施氮量为纯氮9 kg/666.7m2，并以盆的表面积换算得出每盆的施肥量。N∶P2O5∶K2O比例为1∶0.5∶1。氮肥为尿素，磷肥为磷酸二铵，钾肥为硫酸钾。施肥方法是全部的磷肥和50 %的钾肥以及总氮肥量的50 %做基肥，于插秧前全层施用。总氮肥量的20 %做分蘖肥施用，总氮肥量的30 %和50 %的钾肥做穗肥施用。

在抽穗时，选取生长整齐一致且同一天抽出叶鞘3 cm的稻穗挂牌标记，等稻穗完全抽出后分别进行剪穗处理。无穗处理是剪去全部稻穗，半穗处理是剪去上半部分稻穗，留下半部分稻穗，全穗处理是保留全部稻穗。自抽穗后第30、35、40天分别取挂牌标记的稻穗和叶、茎、鞘，取剑叶中间部分5 cm放入冻存管里，置于-80 ℃冰柜里保存备用。剩余的叶、茎、鞘，在105 ℃杀青10 min后65 ℃烘干，供可溶性总糖的测定。收获时按单株收获，自然干燥后供室内考种和品质分析。

1.2 测定方法

1.2.1 可溶性总糖含量测定 采用硫酸蒽酮法[6]测定可溶性糖含量，各样品重复测定3次。

1.2.2 叶片蔗糖代谢相关酶活性测定 参考Rufty[7]和Douglas[8]等的方法，略做改动。

酶液的提取。称取冻存管里的剑叶样品0.5 g左右，用4倍体积的100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.0)缓冲液(内含10 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1EDTA、2 %乙二醇、20 mmol·L-1巯基乙醇)10 mL冰浴中快速研成匀浆，将滤液于4 ℃ 10 000 r/min离心30 min，取上清液置于冰浴，作为粗酶液备用。

蔗糖磷酸合成酶(SPS)活力测定。取0.3 mL的反应混合液，内含50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.0)、10 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1EDTA、2 %乙二醇、20 mmol·L-1巯基乙醇、10 mmol·L-16-磷酸果糖(F6P)、3 mmol·L-1UDPG，另加入0.2 mL酶液在30 ℃水浴中反应30 min，在沸水浴保温4 min，流水冷却，测定体系中蔗糖含量。

酸性蔗糖转化酶(AI)活力测定。取0.3 mL的反应混合液，含50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 4.5)、10 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1EDTA、2 %乙二醇、20 mmol·L-1巯基乙醇，另加入0.2 mL酶液, 37 ℃反应30 min,在沸水浴保温4 min, 流水冷却, 测定体系中蔗糖含量。

蔗糖合成酶(SuS)活力测定。取0.3 mL的反应混合液，内含50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.0)、10 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1EDTA、2 %乙二醇、20 mmol·L-1巯基乙醇、50 mmol·L-1尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，另加入0.2 mL酶液在37 ℃水浴中反应30 min，在沸水浴保温4 min，流水冷却，测定体系中蔗糖含量。

1.2.3 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶和谷氨酰胺合成酶基因mRNA表达量测定 在NCBI上查找相关文献获得基因登录号，经过多重比对粳稻基因库获得基因保守区域，使用Primer 5.0及NCBI内Primer BLAST功能，在基因保守区内设计高特异性的内参基因(OsActin1)和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)和谷氨酰胺合成酶(GS)基因引物(表1)。

表1 RT-PCR目的基因引物

冷酚法提取剑叶中总RNA，利用RNA-free DNaseI去除基因组DNA污染，反转录试剂盒获得cDNA模板。

以逆转录获取的cDNA为模板扩增内参基因条带，PCR程序为：94 ℃ 5 min—94 ℃ 30 s;52.5 ℃ 30 s;72 ℃ 40 s/30个循环—72 ℃ 5 min—16 ℃结束。对扩增产物用1.25 %琼脂糖凝胶进行电泳，利用Quantity one 7.0.5 软件对内参基因RT-PCR产物的电泳谱带亮度进行比较分析，调整体系中cDNA加入量并重复RT-PCR反应至达到条带亮度一致，记录cDNA加入量作为Rubisco和GS基因cDNA模板的加入量，最终得到代表基因表达丰度的亮度条带及Quantity one7.0.5条带亮度平均值的数值。

1.3 数据分析

数据分析使用SPSS和Excel，胶片亮度分析使用Quantity one 7.0.5软件。

2 结果与分析

2.1 不同剪穗处理对产量性状的影响

由表2可见，抽穗后30、35 d时供试的2个品种半穗处理的千粒重、结实率和糙米率均极显著高于全穗处理，到抽穗后40 d时半穗处理仅比全穗处理略高，但差异不显著。说明在同等的“源”条件下减小“库”容有利于提高籽粒的粒重和成熟度，随着“库”容的增加所需的灌浆时间就越长。

2.2 不同剪穗处理对植株可溶性总糖含量的影响

由表3可见，供试的2个品种都表现无穗处理的叶、茎、鞘中的可溶性总糖含量随灌浆进程一直升高的变化趋势，但半穗处理和全穗处理是下降的变化趋势，而且灌浆不同时期不同剪穗处理间叶、茎、鞘中的可溶性总糖含量差异都极显著，无穗>半穗>全穗，说明没有“库”容时光合产物主要贮藏在叶、茎、鞘等营养器官中，但有“库”容时主要转移到“库”中，“库”越大转移的光合产物也越多。

表2 不同剪穗处理间千粒重、结实率、糙米率比较

注：不同小写字母和大写字母间分别表示在0.05和0.01水平差异显著，下同。

Note： Different lowercases and uppercase letters mean significant difference at 0.05 and 0.01 level. The same as below.

表3 灌浆不同时期不同剪穗处理间植株可溶性总糖含量比较

另一方面，在无穗处理下可溶性总糖含量的分布是茎>叶>鞘，在半穗和全穗处理下可溶性总糖含量的分布是茎>鞘>叶。穗重型超级稻品种‘松粳9号’的叶、鞘中的可溶性总糖含量高于穗数型品种‘龙稻11号’，而茎中可溶性总糖含量却‘龙稻11号’高于‘松粳9号’。说明“库”的有无对可溶性总糖含量分布影响很大，无“库”时茎叶是主要贮藏部位，而有“库”时茎鞘是主要贮藏部位，而且超级稻品种合成积累的可溶性总糖含量高于不同品种。

2.3 不同剪穗处理对叶片蔗糖代谢主要酶活性的影响

由图1可见，供试的2个品种抽穗后30～40 d都随灌浆天数的增加而SPS、AI、SuS活性呈下降，期间的酶活性大小而言都表现全穗>半穗>无穗，而且处理间差异都达到极显著水平，说明“库”容量越大SPS、AI、SuS酶活性就越强。

2.4 不同剪穗处理对水稻叶片Rubisco基因mRNA表达量的影响

图1 灌浆不同时期不同剪穗处理间叶片蔗糖代谢主要酶活性比较Fig.1 Comparison of the main enzyme activities of sucrose metabolism in leaves of between different cutting modes at grain filling stage

图2灌浆不同时期不同剪穗处理间叶片Rubisco基因家族mRNA表达量比较Fig.2 Rubisco gene expression in leaves with different cuttings at grain filling stage

图3 在灌浆期不同剪穗处理下叶片谷氨酰胺合成酶基因表达量Fig.3 GS gene expression in leaves under different treatments at grain filling stage

由图2可见，供试的2个品种在抽穗后30、35、40 d叶片中Rubisco大亚基和小亚基基因表达量大小都表现为全穗>半穗>无穗，说明“库”容量越大叶片中Rubisco大亚基和小亚基基因转录表达量也越高。由图2还可见，抽穗后30 d起随着灌浆时间的延长不同剪穗处理的2个供试品种叶片Rubisco大亚基和小亚基基因的mRNA表达量均呈下降趋势。在Rubisco基因家族中大亚基基因OsRBCSL基因的mRNA表达量明显高于其它基因，而其它基因彼此间mRNA表达量差异很小，说明OsRBCSL基因是在灌浆过程中Rubisco基因家族中主要表达的基因。

2.5 不同剪穗处理对叶片谷氨酰胺合成酶基因mRNA表达量的影响

由图3可见，供试的2个品种在抽穗后30、35、40 d叶片中谷氨酰胺合成酶基因mRNA表达量大小均呈为全穗>半穗>无穗，说明“库”容量越大叶片中谷氨酰胺合成酶基因转录表达量也越高。

在不同的剪穗处理下随着灌浆时间的延长，叶片OsGS1;1和OsGS2基因mRNA表达量逐渐下调。OsGS1;1基因在灌浆过程中mRNA表达量均最大，说明OsGS1;1基因在灌浆过程中是GS基因主要表达的基因。穗重型品种‘松粳9号’OsGS1;1和OsGS2基因表达量下降趋势差异不显著，30～35 d下调幅度大，35～40 d下调幅度小。穗数型品种‘龙稻11号’OsGS1;1基因和穗重型品种‘松粳9号’OsGS1;1和OsGS2基因表达量下调趋势基本一致。穗数型品种‘龙稻11号’OsGS2基因表达量下调趋势30～35 d下调幅度小，35～40 d下调幅度大。以上结果说明“库”容量越大，水稻叶片中GS基因表达量越高，随着灌浆时间的延长，GS基因表达量均下调。

2.6 叶片蔗糖代谢相关酶活性与碳氮代谢基因表达量间的相关关系

由表4可见，叶片蔗糖磷酸合成酶(SPS)、酸性蔗糖转化酶(AI)、蔗糖合成酶(SuS)等3个蔗糖代谢相关酶活性与Rubisco同工型基因和谷氨酰胺合成酶同工型基因的转录表达量间均呈极显著的正相关，说明Rubisco同工型基因和谷氨酰胺合成酶同工型基因的上调表达会促进蔗糖代谢相关酶活性。

3 讨 论

表4叶片蔗糖代谢相关酶活性与碳氮代谢基因转录表达量间的相关系数

Table 4 The correlation coefficients between sucrose metabolism related enzymes activities and carbon and nitrogen metabolic gene transcriptional expression in leaf

SPSAISuSOsRBCS20 942∗∗0 938∗∗0 771∗∗OsRBCS30 864∗∗0 784∗∗0 580∗∗OsRBCS40 943∗∗0 857∗∗0 581∗∗OsRBCS50 893∗∗0 900∗∗0 735∗∗OsRBCSL0 846∗∗0 937∗∗0 883∗∗GS1；10 909∗∗0 910∗∗0 717∗∗GS20 806∗∗0 911∗∗0 844∗∗

注： ** 表示达1 %极显著水平。

Note： ** indicate different significance at 1 % level.

水稻秸秆的饲料加工不仅有利于提高水稻秸秆的综合利用率，缓解我国饲料粮紧缺状况，而且有利于实现物质流的良性循环和寒地稻作区的秸秆还田，进而减少秸秆的燃烧量，保护生态环境。水稻秸秆中可溶性碳水化合物可以促进乳酸发酵，为微生物提供能量。通过秸秆的生物发酵把秸秆粗纤维中大分子碳水化合物降解为低分子的单糖或多糖，转变秸秆中的不可溶性碳水化合物为可溶性碳水化合物，使秸秆转变成饲料。因此，秸秆中可溶性碳水化合物含量高低是影响是否适合做饲料的重要因素之一[9]。在我国水稻主要以粮食作物栽培，栽培重点是提高水稻籽粒产量和品质等，从秸秆饲用方面研究报道甚少。本文从秸秆饲用开发层面研究了灌浆成熟期秸秆可溶性总糖含量变化规律。由本试验结果可知，无穗处理的叶、茎、鞘中的可溶性总糖含量随灌浆进程呈一直升高的变化趋势，但半穗处理和全穗处理是下降的变化趋势，没有“库”容时可溶性糖主要贮藏在叶、茎、鞘等营养器官中，但有“库”容时主要转移到“库”中，而且“库”越大转移的可溶性糖也越多。因此，作为粮食和饲料兼用的水稻品种不宜选育“库”大的穗重型品种，应该选育“库”容中等的穗数型品种。而且，在生产上应注意灌浆后期植株可溶性糖含量的变化，收获时期不宜过完，以免植株可溶性糖含量过低而影响秸秆的饲料生产及质量。

水稻籽粒的灌浆物质来源于抽穗前茎鞘NSC和抽穗后的光合产物[10]。潘俊峰[11]等研究结果表明，茎鞘NSC作为临时储藏物质能够在籽粒灌浆成熟期光合能力降低时为产量形成持续提供同化物，并且茎鞘NSC能够激发库活性以及促进籽粒灌浆。翁仁宪等[12]则指出，水稻抽穗期茎鞘中NSC的累积与抽穗至成熟期增加的干重对结实率和产量的作用前者更重要。潘庆民[13]等曾对小麦开花后旗叶中蔗糖的合成与籽粒中蔗糖的降解进行研究指出，旗叶中的蔗糖含量与SPS活性呈显著正相关，SPS活性又与旗叶光合速率呈极显著正相关，而旗叶和籽粒中SuS活性均与籽粒淀粉的积累速率呈极显著正相关。孙庆泉等[14]发现，玉米籽粒中的蔗糖转化酶活性与籽粒充实有关，较高的转化酶活性有利于玉米的高产。水稻籽粒中的AI活性在籽粒灌浆前期活性较灌浆后期高，与SuS一起通过对蔗糖的降解来调控籽粒生长[15]。翁晓燕等[16]研究水稻光合速率、Rubisco及Rubisco活化酶活力的关系时发现，水稻剑叶衰老过程中光合能力的下降与Rubisco活化酶表达密切相关。Martinez等[17]发现玉米低产品系中Rubisco活化酶含量很低，若人为提高Rubisco活化酶水平，则Rubisco和光合速率都随之上升，产量也增加。董明辉等[18]研究表明，籽粒中谷氨酰胺合成酶与抽穗后氮素运转率、籽粒吸氮量和产量均呈显著的正相关。孙国荣等[19]表明，在生殖生长期谷氨酰胺合成酶活性均与产量性状有密切关系，谷氨酰胺合成酶活性可通过调控营养生长期稻株氨代谢而影响生殖生长，最终影响产量。魏颖娟等[20]研究结果表明，可溶性糖含量与光合速率呈极显著负相关，平均籽粒灌浆速率与品种的穗粒类型密切相关，其中，大粒型品种为0.68 mg·d-1，中粒型品种为 0.48～0.51 mg·d-1，小粒型品种为 0.41～0.47 mg·d-1。由本试验结果可知，无论是“库”容大小如何随着灌浆时间的延长，叶、茎、鞘的可溶性总糖含量都缓慢减少，而千粒重、结实率、糙米率等缓慢增加，随着“库”容的增加所需的灌浆时间也随之变长。籽粒灌浆后期剑叶的 SPS、AI、SuS活性均呈下降趋势，期间的酶活性大小表现为全穗>半穗>无穗，“库”容量越大SPS、AI、SuS酶活性以及Rubisco和谷氨酰胺合成酶同工型基因的转录表达量也越高，但受叶片可溶性糖含量的反馈调节作用而酶活性和基因转录表达量也均下降，与前人的众多研究结果相一致。

4 结 论

因此，扩大“库”容和建立畅通的“流”组织即时转移“源”中的光合产物，进而促进Rubisco同工型基因和谷氨酰胺合成酶同工型基因的转录表达及蔗糖代谢相关酶活性是获得更多碳水化合物的重要途径。由于随着“库”容量的增加而灌浆所需时间也变长，因此水稻高产或超高产栽培不仅要构建大的“库”容量，而且还要保证灌浆时间，这对提高粒重和结实率以及籽粒成熟度均具有重要作用。

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