湘鄂不同区域堇叶碎米荠居群间ＲＡＰＤ分析

向极钎 王晓辉 殷红清 万海英 李亚杰 杨永康 丛欣

摘要：采用RAPD分子标记技术对湘鄂5个不同区域的堇叶碎米荠（Cardamine violifolia O. E. Schulz）进行居群间遗传多样性分析，从50个随机引物中筛选出10个条带清晰、多态性明显且重复性好的引物，共扩增出78条DNA片段，其中49条为多态性条带，多态率达62.8%。利用NTSYS 2.10软件进行聚类分析，以相似系数0.68为标准，可将所有居群分为3类，第Ⅰ类为自选品种鄂碎米荠1号和恩施双河鱼塘坝居群;第Ⅱ类为宜昌长阳四方洞居群和湖南常德石门壶瓶山居群;宜昌五峰栗子坪居群独立分为一类。

关键词：堇叶碎米荠（Cardamine violifolia O. E. Schulz）;RAPD;遗传多样性

中图分类号：Q78         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）24-0160-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.043           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Random amplified polymorphic DNA（RAPD） analysis was applied to determine the genetic diversity among 5 Cardamine violifolia O. E. Schulz samples from different region of Hubei and Hunan provinces. 10 among 50 primers were selected to amplify about 78 segments DNA， 49 polymorphic segments were found， the percentage of polymorphic probability was 62.8%. Cluster analysis using NTSYS software， a similar coefficient of 0.68 as the standard， all varieties can be divided into three categories. GroupⅠincluding C.violifolia Hubei “1” and Yutangba Shuanghe of Enshi City; GroupⅡ including Sifangdong Changyang Yichang City and Hupingshan Changde City; Liziping Wufeng Yichang City was divided into a class of independent.

Key words： Cardamine. violifolia O. E. Schulz; RAPD; genetic diversity

堇葉碎米荠（Cardamine violifolia O.E. Schulz）属十字花科（Brassicaceae）碎米荠属（Cardamine）植物，主要分布在湘鄂武陵山区的高山沟谷溪边，含有丰富的蛋白质、可溶性糖、氨基酸、纤维素等营养元素[1]，且具有超富集硒的特性，通过补硒栽培其有机硒的含量可以达到1 399.59 mg/kg WD[2]，其嫩茎、叶均可食用，在实地调查中当地居民多称其为“野油菜”“水油菜”或“岩板菜”，是一种优质的野菜资源。

从2002年以来湘鄂武陵山区相继发现并命名了3种碎米荠属植物：壶瓶山碎米荠（C. hupingshanensis L.H.Liu）[3，4]、堇叶碎米荠（C. violifolia O.E. Schulz）[5]和恩施碎米荠（C. enshiensis Y.Y.Wu & T.Y.Xiang）[6]，由于从外部形态上无法区分该种植物及其地域性，同时出现了同种异名的现象，造成研究上的重复，虽然有学者将这3种碎米荠归为同一个种[7]，但并未给出分子生物学上的依据。2014年有学者分别从4个有代表性的地点（恩施双河、宜昌五峰、宜昌长阳和石门壶瓶山）采集不同居群的壶瓶山碎米荠、恩施碎米荠和堇叶碎米荠，通过nrDNA ITS序列分析发现4个居群间的碎米荠遗传距离在0～0.003，说明了4个不同区域的碎米荠为同一个种，统称为堇叶碎米荠[8]。

RAPD（Random amplification of polymorphic）标记是利用一个10碱基序列的引物，通过PCR扩增的多态性来检测供试材料基因组间的遗传变异[9]。RAPD分子标记技术在十字花科蔬菜研究中应用广泛，在检测基因组DNA多态性的方面具有快速、简便、高效等优点，已应用于十字花科蔬菜的品种鉴定、分类与演化、亲缘关系与遗传多样性等各个领域的研究。Mailer等[10]利用RAPD方法鉴定了澳大利亚甘蓝型油菜所有品种，利用100个引物对23个油菜品种进行RAPD分析，其中70个引物产生了DNA电泳条带，20个表现出多态性，6个引物就可以区分23个油菜品种。Hu等[11]用4个随机引物对14个青花菜品种和12个花椰菜品种进行RAPD检测，结果表明，2个引物就足以鉴定或区别14个青花菜品种，3个引物就足以区分12个花椰菜品种。乔爱明等[12]对8个芥菜变种的16个品种（每个变种有2个品种）进行RAPD鉴定，结果表明，筛选出了7个有效引物在16个品种上都有特征DNA条带。

本试验以湘鄂4个不同居群的堇叶碎米荠和自选的堇叶碎米荠品种鄂碎米荠1号为材料，通过RAPD标记技术对不同居群间的堇叶碎米荠在全基因组层面进行亲缘关系分析，以期发现不同居群间的堇叶碎米荠是否存在差异，并尝试筛选可用于湘鄂不同区域堇叶碎米荠居群鉴别的引物，为今后该超聚硒植物的多样性保护和遗传亲本选配，以及开发利用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  供试样品  供试样品为在2017年收集的湘鄂5个不同区域堇叶碎米荠居群50株混合鲜叶，采样信息见表1。

1.1.2  主要仪器  高压蒸汽灭菌锅（上海东亚容器01J2003-04）、超低温冰箱（SANYO MDF-392）、冰箱（Hair 208K/ANCINA）、制冰机（SCOTSMAN DA24845-3）、PCR扩增仪（德国Eppendorf 5331）、高速低温离心机（德国Eppendorf 5417R）、电泳仪（北京六一DYY-4C）、涡旋振荡器（美国Scientific Industries Vortex-Genie 2）、电子天平（赛多利斯Secura？誖）、凝胶成像系仪器（美国伯乐Gel Doc 200）、超微量紫外可见分光光度计（北京普析TU-1810）。

1.1.3  主要试剂  试验所设计的RAPD引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA提取试剂盒、PCR扩增所用试剂购于宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2  试验方法

1.2.1  基因组DNA提取  堇叶碎米荠DNA提取使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extration Kit，用超微量紫外可见分光光度计和1.3%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的纯度与浓度。

1.2.2  RAPD PCR扩增  反应体系总体积25 μL，含有1 μL基因组DNA（30 ng），1 μL引物（5 μmol/L），2.5 μL 10×PCR Buffer反应缓冲液，2 μL MgCl2（25 mmol/L），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.2 μL Taq酶，用ddH2O补充体积至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，35.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，38个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物使用1.3%的琼脂糖凝胶电泳分离，电压110 V，电泳35 min，在凝胶成像仪上观察照相、记录。

1.3  数据分析

根据各分子在相同电泳迁移率（相对分子质量片段）的有无，统计得到所有条带的二元数据，有DNA扩增条带记为1，无带记为0，利用Ntsys 2.10计算出遗传相似系数、构建聚类图。

2  结果与分析

2.1  堇葉碎米荠基因组DNA提取

由图1可以看出，提取的DNA经1.3%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰。由表2可知，提取的堇叶碎米荠的基因组DNA OD值和含量正常，表明DNA的质量满足后续试验的要求。

2.2  引物PCR扩增结果

从50个随机引物中筛选出10个条带清晰、多态性明显并且重复性好的引物（表3）。10个引物共扩增出78条DNA片段，其中49条为多态性条带，占总扩增条带数的62.8%。RAPD引物S02的PCR扩增结果见图2。

2.3  遗传相似性分析

利用RAPD标记扩增DNA片段，通过Ntsys计算出遗传相似系数（GS）。RAPD标记表明，5个区域堇叶碎米荠居群间的遗传相似系数在0.076 0～0.804 5（表4），平均值为0.440 3。其中，恩施州农科院产业园自选品种鄂碎米荠1号（ES）与双河鱼塘坝硒矿区（SH）GS值最大，为0.804 5，宜昌的五峰县（WF）与宜昌长阳县（CY）GS最小，为0.076 0。

2.4  聚类分析结果

由图3可知，以相似系数0.68为标准，可将5个不同区域的堇叶碎米荠分为3大类，第Ⅰ大类包括恩施州农业高新技术产业示范园自选品种鄂碎米荠1号（ES）和恩施双河鱼塘坝（SH），第Ⅱ类包括宜昌长阳四方洞（CY）和湖南石门壶瓶山（HPS）;宜昌的五峰栗子坪（WF）独立分为一类。

3  讨论

RAPD分子标记技术是利用10个碱基的随机引物，通过PCR扩增来检测DNA多态性的技术[13]。RAPD与其他分子标记技术相比具有众多的优越性：引物可以随机设计，并可用于不同样本基因组多样性检测分析，具有广泛性和通用性，且试验费用低;可检测的多态性位点是无限的，灵敏度高，能够检测出不同样本间的微小差异;所需检测样本DNA用量少，纯度要求不高，试验过程中不需要进行额外的Southern转移、分子杂交等繁琐的程序，可同时检测大量样本。

本试验以湘鄂地区5个不同区域堇叶碎米荠居群为供试材料，从50个随机RAPD引物中成功筛选出10个有效引物，结果反映5个不同区域的堇叶碎米荠在居群间存在一定的差异，而且这种差异是可以通过RAPD标记技术显示出来的，这为应用RAPD标记技术快速、准确地进行堇叶碎米荠遗传多样性分析和居群间分子鉴别等研究提供理了论基础。构建的聚类图可以反映亲缘关系与地理分布的相关性，本试验中恩施双河鱼塘坝的堇叶碎米荠和自选品种鄂碎米荠1号聚为一类，这可能是由于自选品种是多年来对双河鱼塘坝区域堇叶碎米荠进行的野转家栽培和品种选育使它们之间的基因组差异不显著造成的，这种亲缘关系与地理分布的联系也与朱莉等[14]对湖北、湖南白菜型油菜品种的RAPD分析中得到的结果相类似。通过全面的分析湘鄂地区堇叶碎米荠种质资源的变化，有利于选育更加优质的种质资源，为今后更好地开发利用该野生植物资源以期将其申报为新食品原料服务于人们的健康，以及利用生物技术进行该独特资源硒富集途径关键基因的克隆和表达的基础研究提供了可靠的材料基础和科学依据。

本试验由于采集的样本只限于湘鄂西部临近地区，C. violifolia O.E.Schuiz已被处理为露珠碎米芥C. circaeoides J.D.Hooke被视为同物异名[15]，采样的范围没有扩大到全国该植物的多数分布区域，造成本试验结果只适用于湘鄂地区的堇叶碎米荠的研究，但这为以后能更全面地进行该植物的研究分析奠定了前期基礎，同时该种植物的起源中心和不同区域的遗产变异类型还有待进一步探索和研究。

参考文献：

[1] 丁  莉，彭  诚.堇叶碎米荠营养成分的分析与评价[J].湖北民族学院学报（自然科学版），2005（3）：293-295.

[2] 向极钎，杨永康，殷红清，等.堇叶碎米荠人工补硒栽培技术研究[J].湖北民族学院学报（自然科学版），2012，30（4）：421-423.

[3] 龙跃生.碎米荠属一新种——壶瓶碎米荠（Cardamine. hupingshanensis L.H.Liu）的核型分析及其近缘种ITS序列进化的研究[D].长沙：湖南师范大学，2002.

[4] 王玉兵，陈发菊，梁宏伟.湖北省碎米荠属一新记录种——壶瓶碎米荠[J].湖北农业科学，2010，49（9）：2160-2161.

[5] 丁  莉，彭  诚.堇叶碎米荠营养成分的分析与评价[J].湖北民族学院学报（自然科学版），2005，23（3）：293-295.

[6] 向天勇.恩施碎米荠的生物学特性及叶片含硒化合物研究[D].长沙：湖南农业大学，2006.

[7] 白宏锋，李晓明，周继业.壶瓶碎米荠种子的萌发特性研究[J].安徽农业科学，2010，38（7）：3403-3405.

[8] 向极钎，李锡香，王  萌，等.不同产区碎米荠nrDNA ITS序列分析及亲缘关系鉴定[J].湖北农业科学，2014，53（19）：4737-4740.

[9] 胡裕清，赵树进.RAPD技术及其在植物研究中的应用[J].生物技术通报，2010（5）：74-77.

[10] MAILER R J，SCARTH R，FRISTENSKY B. Discrimination among cultivars of rapeseed（Brassica napus L.） using DNA polymorphisms amplified from arbitrary primers[J].Theoretical and Applied Genetics，1994，87（6）：697-704.

[11] HU J，QUIROS C F. Identification of broccoli and cauliflower cultivars with RAPD markers[J].Plant Cell Reports，1991，10（10）：505-511.

[12] 乔爱民，刘佩瑛，雷建军.芥菜16个变种的RAPD研究[J].植物学报，1998，40（10）：36-42.

[13] 谭  云，李忠海，黎继烈，等.RAPD分子标记技术在植物研究上的应用[J].安徽农业科学，2013，41（25）：10236-10238.

[14] 朱  莉，李汝刚，伍晓明，等.我国部分白菜型油菜RAPD的研究[J].生物多样性，1998，6（2）：20-25.

[15] WU C Y，RAVEN P H. Flora of China（Vol. 8）[M].Beijing： Science Press，2001.100.