真菌ＳＦ＿２４８１８中抗菌活性成分的研究

吴兆圆 张亚妮 方伟 石丽桥 刘曼莉

摘要：在抗菌活性天然产物的筛选过程中，筛选到一株具有强抗菌活性的真菌SF_24818，通过活性跟踪，确定其中的活性组分，并大量发酵菌株，经提取和制备高效液相色谱，分离得到2个抗菌活性化合物，经紫外、质谱和核磁共振确定化合物为新羟基曲霉酸和曲霉酸，进一步的抗菌活性测试表明其具有显著的抗金黄色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）作用。

关键词：抗菌活性;真菌;新羟基曲霉酸;曲霉酸

中图分类号：S482.2+92         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）24-0093-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.025           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： In the search for antimicrobial natural products， fungus SF_24818 with strong antimicrobial activity was obtained. By active tracking，the active fraction was detected，and two active compounds which were identified as neohydroxyaspergillic acid and aspergillic acid by UV，MS and NMR were isolated from the culture of large scare fermentation of SF_24818. Further antimicrobial activity tests showed that the two active compounds had significant antimicrobial effect to Staphylicoccus aureus.

Key words： antimicrobial activity; fungi; neohydroxyaspergillic acid; aspergillic acid

細菌性传染病一直是人类和动物健康的重要威胁。抗生素在控制细菌感染中发挥着重要作用。但临床多重耐药菌株、超级耐药细菌的出现，均提示现有抗细菌感染的药物已不能满足动物和人类防控细菌感染的需求。因此迫切需要研究新的抗细菌药物。

真菌分布广泛，从陆地到海洋，从动物到植物，乃至其他微生物，几乎都有真菌的存在。正是由于真菌的物种多样性与生态环境的多样性导致了其次生代谢产物结构和生物活性的多样性，因而一直以来都是药物及其先导化合物的重要来源之一[1，2]。临床上广泛使用的青霉素、洛伐他汀、环孢素以及棘白霉素等药物，都是真菌次生代谢产物或其衍生物[3]。

在抗菌活性筛选过程中，湖北省生物农药工程研究中心课题组筛选到一株强抗菌活性真菌SF_24818，通过活性追踪，得到其中的抗菌活性化合物，经LC_MS和NMR鉴定为曲霉酸（Aspergillic acid）和新羟基曲霉酸（Neohydroxyaspergillic acid）。

1  材料与方法

1.1  主要仪器和试剂

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振仪（TMS为内标，δ为mg/L，J为Hz）（德国Bruker BioSpin公司）;Waters 2695液质联用仪（美国Waters公司）;Water 2767高效液相制备仪（Waters 2525泵，带2767自动收集系统，2996二级管阵列检测器，色谱工作站Masslynx V4.0）;美国Sunfire C18 OBD制备柱（5 μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，爱尔兰）。分离提取用试剂乙酸乙酯和乙腈均为国药集团生产。

1.2  菌株

1.2.1  化合物产生菌  编号SF_24818菌株分离自武汉市周边土壤样本，由湖北省生物农药工程研究中心保存。

1.2.2  细菌菌株  大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）、沙门氏菌（Salmonella enterica）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、乙型链球菌（Beta streptococcus）菌种由湖北省生物农药工程研究中心保存。

1.3  化合物的培养和提取

菌株SF_24818的种子在ISP-2培养基（麦芽糖6.25 g/L，麦芽提取物6.25 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氢钾1.25 g/L，硫酸镁0.625 g/L，pH调至7.0）中于28 ℃，以转速120 r/min进行振摇培养。发酵96 h后，在无菌条件下将种子发酵液转入ISP-2培养基中，接种量为10%（V/V），在28 ℃的温度下，在摇床上以120 r/min的转速进行培养120 h。

初筛时发酵液为50 mL，冷冻干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，离心，取上层有机相，回收乙酸乙酯后加入1 mL甲醇溶解，作为活性测试和活性跟踪样品。大量发酵为20 L的发酵液中加入20 L的乙酸乙酯搅拌提取3次，提取液过滤后真空浓缩得到提取物。

1.4  活性跟踪和分离纯化

取初筛样品进行半制备（Sunfire C18 OBD制备柱，5 μm，10 mm×250 mm，7.5 mL/min），洗脱梯度为5%～100%乙腈，洗脱40 min，得到36个组分，溶剂挥发干后，用1 mL甲醇溶解作为活性测试样品。

大量发酵的乙酸乙酯提取物溶解于甲醇中，用反相制备色谱柱（Sunfire C18 OBD制备柱，5 μm， 19 mm×250 mm，27 mL/min）进行粗分，洗脱梯度为5%～100%乙腈，洗脱40 min，然后再针对活性化合物进行细分，采用洗脱梯度10%～60%得到化合物1和化合物2。

1.5  提取物抗菌活性测试

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、乙型链球菌菌种在营养琼脂斜面培养基上传代培养1次后，再将其接种至营养肉汤培养基中，37 ℃培养6～12 h为种子菌液。将种子菌液按培养基总体积的1‰接种于营养肉汤培养基，37 ℃培养至对数生长期，然后将菌液稀释至1×106 CFU/mL备用。待测样品用乙醇溶解，转移至96孔板，待乙醇挥发干后，加入菌液200 μL/孔，使待测样品终浓度约为20 μg/mL，振荡混匀后37 ℃培养12～24 h，用酶标仪测OD630 nm，同时设空白培养基对照孔和不加药的菌液对照孔。以培养基为空白（0），以未处理带菌培养液为对照（100%），计分方法：“-”为无死亡;“+”为少于25%死亡;“++”为25%～50%死亡;“+++”为50%～75%死亡;“++++”为超过75%死亡。

2  结果与分析

2.1  活性测试结果

初筛结果（表1）表明，SF_24818的乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌以及乙型链球菌均呈现较强的抗菌活性。活性跟踪结果（表1）表明，组分11和组分15具有强抗菌活性，其中组分15对所有病原菌都呈现>75%的抗菌活性。SF_24818大量发酵后，根据LC_MS分析，活性组分11和组分15所含主要化合物分别为化合物1和化合物2，分离纯化后再次進行活性测试，表明化合物1和化合物2为抗菌活性化合物。

2.2  化合物结构鉴定

化合物1（图1）：淡黄色粉末;UV（MeOH）λmax：228，320 nm;ESI-MS（阳离子）：165.2，207.3，225.3[M+1]+;ESI-MS（阴离子）：108.0，151.1，223.2[M-1]（图2、图3）。根据化合物的紫外以及质谱数据，查询天然产物词典（Dictionary of Natural Products on CD-ROM，2009版），结合文献报道[4]，鉴定为曲霉酸。

化合物2（图1）：UV（MeOH）λmax：240，326，365（sh） nm;ESI-MS（阳离子）：162.5，206.3，241.4[M+1]+;ESI-MS（阴离子）：167.1，239.2[M-1]（图2、图3）。根据化合物的紫外以及质谱数据，查询天然产物词典，推测化合物为新曲霉酸类化合物，进一步通过13C-NMR数据[5]，鉴定为新羟基曲霉酸。13C-NMR（CD3OD，125 MHz）：155.8（C-2，s），154.3（C-3），122.4（C-5），142.6（C-6），43.0（C-7），28.4（C-8），23.0（C-9），23.0（C-10），72.5（C-11），33.6（C-12）， 19.9（C-13），16.8（C-14）。

3  讨论

抗生素在畜牧业中的应用非常广泛，据统计，中国生产的抗生素原料有接近半数用于畜禽养殖业[6]。抗生素的大量使用容易造成耐药菌的产生，同时存在抗生素残留等问题。尽管现在一般使用专用的饲料抗生素，但是由于存在监管问题，人用抗生素的滥用也是较为普遍的问题，这将很大程度上增强人感染微生物的耐药性，给人类生命健康带来严重威胁[7，8]。进一步加快专门的畜牧用抗生素的研发是解决途径之一。在本研究中，筛选到具有抗菌活性的化合物曲霉酸和新羟基曲霉酸，这类化合物早期就被发现具有抗菌活性[9，10]。表明从真菌中发现活性抗菌化合物是一个较好的途径，另外，随着耐药菌的出现以及新机制的发现，对一些已知化合物的抗菌活性再评价也是有必要的。

参考文献：

[1] TAN R X，ZOU W X. Endophytes： A rich source of functional metabolites[J].Natural Product Reports，2001，18（4）：448-459.

[2] NEWMAN D J，CRAGG G M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010[J].Journal of Natural Products，2012，75（3）：311-335.

[3] GE H，TAN R. Symbionts，an important source of new bioactive natural products[J].Progress in Chemistry，2009，21（1）：30-46.

[4] DUTCHER J D. Aspergillic acid：An antibiotic substance produced by aspergillus flavus：Ⅲ.The structure of hydroxyaspergillic acid[J].Journal of Biological Chemistry，1958，232（2）：785-796.

[5] OHTA A，AKITA Y，IZUMIDA A，et al. Synthesis of dl-Neohydroxyaspergillic acid[J].Chemical & Pharmaceutical Bulletin，1979，27（6）：1316-1320.

[6] 万遂如.关于我国畜牧业生产中限制抗生素的使用问题[J].养猪，2017（1）：1-5.

[7] 刘秀玲，卢静义.抗生素在畜牧业中的应用现状及其潜在危害分析[J].兽医导刊，2012（2）：46-47，54.

[8] 董玉瑛，张  阳，郭幸丽，等.畜牧业中抗生素的环境归趋·危害与防治[J].安徽农业科学，2008，36（6）：2512-2513，2519.

[9] WEISS U，STRELITZ F，FLON H，et al. Antibiotic compounds with action against bacterial viruses：Neohydroxyaspergillic acid[J].Archives of Biochemistry & Biophysics，1958，74（1）：150-157.

[10] DUNN G，NEWBOLD G T，SPRING F S. Structure of the antibacterial compound，aspergillic acid[J].Nature，1948，162（4124）：779-780.