Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物的构建 及在滑膜肉瘤小鼠模型上的应用

朱甲麟，许 珂，蔡永松，阳 乐，吴小庆，许 鹏

(西安交通大学附属红会医院关节外科，陕西西安 710061)

滑膜肉瘤(synovial sarcoma)是一种恶性软组织肿瘤，起源于滑膜细胞或分化为滑膜细胞的间充质细胞，约占软组织肉瘤的7%～10%[1]。滑膜肉瘤的患者以儿童和青少年为主，患者多集中在40岁以下男性[2]。滑膜肉瘤的早期症状通常表现为疼痛、局部肿块，随着病程进展，肿瘤侵及关节，患者可出现关节活动受限，伴有肺转移者可出现咳嗽等呼吸道症状[3-4]。由于滑膜肉瘤症状不具典型性，而且比较少见，人们对其了解也不多，因而极易被忽视，从而造成严重的后果，危及患者生命。

在医学界，对滑膜肉瘤的研究并不多。目前的研究多集中在临床诊断方面，基础方面的研究十分有限，其中一个重要的原因就是滑膜肉瘤的动物模型制作比较困难。滑膜肉瘤动物模型的制作多采用异体移植的方法，将人的肿瘤细胞移植到免疫缺陷动物，制作成异种移植性肿瘤模型。然而，由于人与模型动物遗传上的差别以及滑膜肉瘤本身的特点，目前的滑膜肉瘤移植瘤模型的成瘤率仍很低，制作周期长，且成瘤体积较小，取材困难。

本实验应用组织工程学的方法，选取人类滑膜肉瘤细胞系SW982，制作了Metrigel-VEGF-SW982的细胞支架复合物，对SW982做3D立体式培养，观察SW982细胞在立体培养条件下的生物学特征。将细胞支架复合物应用于重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠滑膜肉瘤移植瘤模型的构建中，为其他软组织肿瘤动物模型的建立和研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 SPF级雌性SCID小鼠10只，4周龄，体质量20 g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。DMEM高糖培养基(Hyclone美国)，胎牛血清(Gibco美国)，SW982细胞系(ATCC美国)，Metrigel(BD美国)，VEGF(Thermo美国)，胰酶(Sigma美国)，Transwell小室(Corning 美国)，兔抗人上皮细胞膜抗原(EMA)抗体(CST美国)，小鼠抗人细胞角蛋白(CK)抗体(CST美国)，Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG、Alexa Fluor 555标记的羊抗小鼠IgG(博奥森中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 SW982细胞的复苏与扩增培养 将保存有SW982细胞的冻存管从液氮中取出，装入无菌自封口袋中，立刻置入37 ℃水浴锅中使其快速升温，期间应不断的震荡冻存管以便细胞受热均匀。期间应注意观察细胞解冻情况，避免升温过高，导致DMSO对细胞产生毒性作用。待细胞刚融化呈液态，将细胞从水浴锅中取出，置于冰上，迅速转移至超净台内进行后续试验。用移液器吸取解冻的SW982细胞悬液，置入10 mL的DMEM高糖培养基中(含100 mL/L胎牛血清，25 mmol/L HEPES，100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素)，轻柔摇晃使细胞分布均匀。将复苏的细胞放置在恒温培养箱中，37 ℃，50 mL/L CO2条件下培养48 h。期间不更换培养液，以便尽可能多的细胞贴壁。

1.2.2 SW982细胞的免疫荧光染色鉴定 待SW982细胞传至第4代，将细胞接种于底部放置玻片的12孔板中进行培养，待细胞爬片生长至70%～80%融合时，40 g/L多聚甲醛进行固定封闭，用兔来源的抗上皮细胞膜抗原(EMA)抗体和小鼠来源的抗细胞角蛋白(CK)抗体孵育细胞，分别采用荧光素Alexa Fluor 488(绿色)标记的羊抗兔IgG和荧光素Alexa Fluor 555(红色)标记的羊抗小鼠IgG进行荧光双染。荧光显微镜下观察SW982细胞EMA和CK的表达情况。同时设立阴性对照组(以PBS代替一抗)。

1.2.3 Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物的构建及3D立体式培养 待细胞传代扩增至4～6代时，用2.5 g/L胰酶将贴壁的SW982细胞消化下来，加入含100 mL/L PBS的培养基终止消化，离心弃上清，重悬细胞并调整细胞密度为2×107/mL。取1 mL 细胞悬液，再次离心，弃上清。提前1 d将Metrigel置于4 ℃使其融化，用1 mL Metrigel重悬细胞，并加入小鼠重组VEGF使其终质量浓度达到10 ng/mL。用Metrigel重悬细胞时，动作要轻柔，避免吹出气泡，反复吹打多次，使细胞分布均匀。整个重悬过程需在冰上进行以防止Metrigel凝固。将混合均匀的Metrigel-VEGF-SW982悬液200 μL滴加到膜孔径0.45 μm的Transwell小室中，置于37 ℃培养箱中培养1 h，使Metrigel凝固成胶冻状态。将Transwell小室置于24孔板中，在24孔板及小室中加入细胞培养液37 ℃，50 mL/L CO2培养过夜。在超净工作台中，用无菌手术刀片将Transwell小室底部的薄膜切除，小心取出Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物。用OCT将细胞支架复合物进行包埋，-20 ℃下，切取10 μm厚的冰冻切片，苏木精-伊红(HE)染色后，封片，于光镜下进行观察。

1.2.4 移植构建SCID小鼠的滑膜肉瘤模型 将10只4周龄SCID雌性小鼠于SPF动物房饲养2周，以适应环境。将SCID小鼠随机2组，每组5只，用100 g/L水合氯醛按照350 mg/kg体质量的比例，进行腹腔注射麻醉。对照组采用常规的细胞悬液注射方式进行移植造模：用不含血清的DMED高糖培养基制作细胞悬液，细胞密度为2×107/mL，于小鼠左腋下注射200 μL细胞悬液；支架组采用细胞支架复合物：切开腋窝外侧缘左侧腋下皮肤，用眼科镊对皮下组织进行钝性分离，将构建好的Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物于外侧切口处送入腋窝中心，缝合切口。常规消毒切口，臀部注射8万单位青霉素钠3 d以预防感染。

8周后，断颈处死所有模型鼠，切开腋下皮肤，观察模型鼠成瘤情况。以用肉眼可观察到接种部位有新生包块为成瘤标准，计算成瘤率(成瘤率=成瘤鼠数量/每组模型鼠数量)。将包块完整剥离。采用40 g/L多聚甲醛固定24 h，流水冲洗24 h，经乙醇梯度脱水，二甲苯透明后，用石蜡进行包埋，制作5 μm的石蜡切片，HE染色后于光镜下观察。在两组中分别随机选取10个视野，计算每个视野中的新生血管数，比较两组肿瘤中新生血管数量的差异。

2 结 果

2.1 SW982细胞形态学及免疫学特征 镜下观察，可见SW982细胞形态呈多样性。初期细胞密度较低，单个细胞呈长梭形或多边形，胞质颜色较深, 多数可见有颗粒存在。细胞核透亮,大小不等，有多个核仁。细胞周围有突起伸出，通过突起与周围细胞相连。随着不断分裂，细胞排列紧密，呈镶嵌式排列或堆叠生长。细胞形态也较刚复苏时有明显的不同，在细胞密集排列处，SW982的突起回缩，呈多边形或不规则形态，具有恶性细胞的特征(图1)。

免疫荧光染色显示，多数细胞EMA呈阳性(荧光素Alexa Fluor 488)，荧光显微镜下可观察到多数梭形细胞胞质内有绿色荧光表达；而CK表达呈弱阳性(荧光素Alexa Fluor 555)，荧光显微镜下约有半数细胞可观察到红色荧光。实验设置的阴性对照组均无红色或绿色荧光表达。EMA和CK均为人滑膜肉瘤主要的细胞标记物，荧光染色结果表明SW982细胞为人滑膜肉瘤来源(图2)。

2.2 Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物的形态与组织学特征 Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物外观呈白色不透明胶冻状，镜下观察，呈毛玻璃样，透光度较低。SW982细胞在支架内呈颗粒状，细胞密度高，分布较均匀。将复合物置于OCT包埋剂中，制作冰冻切片，HE染色显示，SW982细胞呈颗粒状分布于Metrigel内，细胞分布均匀，大小均一，亦可见由多个细胞组成的细胞团块。细胞支架复合物中有空泡出现，空泡中也有SW982细胞分布(图3)。

图1 滑膜肉瘤细胞SW982在光镜下的组织形态学特点Fig.1 Morphobiological features of synovial sarcoma SW982 cells

A：单个SW982细胞形态(×400)；B：大量SW982细胞堆叠生长时的细胞形态(×200)。

2.3 SCID小鼠的滑膜肉瘤模型造模结果 造模8周后，所有SCID鼠均存活下来。部分SCID鼠腋下出现圆形或卵圆形的包块，表示造模成功。对照组仅有1只有肿瘤生成，成瘤率20%；而支架组有3只造模成功，成瘤率60%。支架组新生肿瘤的直径较对照组明显增大(图4)。

将新生肿瘤经固定包埋切片，HE染色，镜下可见支架组细胞密度较大，有新生血管生成。肿瘤细胞分布不均匀，新生血管周围有大量肿瘤细胞聚集，细胞呈圆形或卵圆形，胞核着色较深，呈团簇样密集分布；而远离血管处，细胞分布稀疏，呈长梭形或多边形。对照组肿瘤内，细胞密度较小，分布稀疏，血管生成少，细胞成梭形。在低倍镜视野下，支架组新生血管数量平均为4.2个；而对照组新生血管数量，平均为0.8个(图5)。

图2 滑膜肉瘤细胞SW982免疫荧光染色鉴定结果

Fig.2 Immunofluorescence staining of synovial sarcoma SW982 cells

A：DAPI(×100)；B：抗EMA染色，Alexa Fluor 488(×100)；C：抗CK染色，Alexa Fluor 555(×100)；D：Merged(×100)。

图3 Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物的组织形态学特点

Fig.3 Histological characteristics of Metrigel-VEGF-SW982 complex

A：利用Transwell构建的Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物；B：细胞支架复合物的外观；C：SW982细胞在细胞支架中生长(×100)；D：细胞支架复合物HE染色(×100)。

图4 不同组间成瘤率与新生肿瘤体积对比

Fig.4 Comparison of tumor formation rate and tumor volume in different groups

A：模型鼠腋下有圆形质韧肿瘤形成；B：支架组与对照组新生肿瘤大小对比；C：对照组与对照组成瘤率对比。

图5 不同组移植瘤内新生血管数量

Fig.5 The number of new blood vessels in different groups of transplanted tumors

A：支架组(×100)；B：对照组(×100)；C：两组移植瘤内新生血管数对比，*P<0.05。

3 讨 论

滑膜肉瘤是一种恶性度高、侵袭性强的软组织肿瘤。滑膜肉瘤的治疗方法以手术切除为主，并辅以术后的放疗与化疗[5]。据报道滑膜肉瘤术后的5年生存率仅50%，远期生存率不到30%。影响其预后的主要原因是放化疗敏感性减退和肿瘤复发[6-7]。因而研究滑膜肉瘤的抗药机制，寻找促使其凋亡的新作用靶点尤为重要。

SCID小鼠，是既具有先天免疫缺陷,又有T和B淋巴细胞缺乏的免疫缺陷小鼠，各种肿瘤细胞可以植入,且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病。将人体肿瘤移植于SCID小鼠，既能最大程度的保持其生物学特性，又能降低宿主的排异反应，因而SCID鼠是制作肿瘤移植模型的最佳实验动物。应用免疫缺陷动物制作移植性肿瘤模型，是目前应用比较广泛的肿瘤动物模型制作方法，肝癌[8]、肺癌[9]、胃癌[10]以及乳腺癌[11]、宫颈癌[12]、卵巢癌[13]的移植瘤模型都已经建立并得到广泛应用。1994年，华西医科大学的毛新和日本北海道大学医学部的阿部周一，将1例日本滑膜肉瘤患者的肿瘤组织样本，接种于裸鼠，制作出了滑膜肉瘤的异种移植动物模型[14]。但由于滑膜肉瘤发病率较低，肿瘤组织样本获取难度较大，且滑膜肉瘤患者的个体差异较大，利用患者组织块直接移植造模的方法很难做到标准化并加以推广。

滑膜肉瘤起源较为复杂，且肿瘤细胞具有双向分化的特性[15]，上皮性肿瘤标志物和间叶组织标志物在不同类型的滑膜肉瘤中，其表达程度也有一定的差别[16]。EMA是滑膜肉瘤的一个重要的上皮性肿瘤标志物，EMA表达于大多数滑膜肉瘤中，敏感度可达91%，是最敏感的细胞鉴定标志。CK是滑膜肉瘤的另一个重要的标志物，其敏感性虽不及EMA，但其特异度较高，其中CK7和CK19的特异度可达96%[17]。SW982细胞来源于人滑膜肉瘤，是一种较为常用细胞株。实验中对SW982细胞进行肿瘤标志物鉴定，发现SW982的EMA表达呈阳性，几乎所有细胞均可观察到明显的绿色荧光。CK在SW982细胞中也呈中等强度阳性表达，由此可得出结论SW982细胞作为制作滑膜肉瘤动物模型的种子细胞是可靠的。SW982细胞生物功能稳定，恶性度高，侵袭性强，对化疗药物耐受性好，这些生物学特性与临床上滑膜肉瘤的特点极其相似[18-19]。黄哲[20]从SW982细胞中分离出滑膜肉瘤干细胞，应用干细胞悬液对裸鼠进行皮下注射，制作出滑膜肉瘤的异种移植模型。实验中发现SW982细胞的活性对于移植造模成功与否至关重要，由于SW982细胞代谢高度旺盛，应采用高糖的DMEM培养基，同时密切观察细胞的活性，避免因养分不足造成细胞活性下降或凋亡。

Metrigel是一种可溶性的三维培养基，常温下可自动聚合形成类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料，能够模拟在体细胞基底膜的组织结构，拥有类似的理化特性和生物活性功能[21]。本实验的对照组采用的是常规的细胞-培养基混悬液腋下注射造模的方法，由于液体有较大的流动性，注射的肿瘤细胞易分散，难以在局部形成高密度的细胞群落，因而造模成功率比较低。而采用Metrigel的支架组能够将细胞聚集在一个立体的环境中，形成高密度的细胞群落，加强细胞之间的联系，有利于肿瘤的生长。从实验结果中可以看出，利用细胞支架复合物制作的模型，肿瘤体积较对照组大，肿瘤内细胞密度也较对照组高。

VEGF是目前所发现的最重要的促血管生成因子。VEGF可以调节体内血管的通透性，为血管形成过程中的多种细胞提供一个纤维网络，促进血管新生[22]。肿瘤细胞是代谢高度旺盛的细胞，需要消耗大量的养分[23]。起初肿瘤可以依靠宿主终末毛细血管渗透所提供的养分生长，当肿瘤生长至直径1～2 mm 时，经微循环渗透提供的营养物质已不能满足肿瘤的生长需要，此时来自宿主的血管内皮细胞及平滑肌细胞被募集并进入肿瘤内部，形成新生的毛细血管网，为肿瘤内部的细胞提供养分[24]。本实验在细胞支架复合物中加入了VEGF，因而新生肿瘤内部有较多的血管形成。新生血管为周围肿瘤细胞提供养分，血管周围的肿瘤细胞密度也较远离血管处高。VEGF的应用，极大地促进了肿瘤的生长。

本实验通过采用组织工程学的方法，利用Transwell小室，构建出Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物，充分利用立体培养基Metrigel的生物活性特点，模拟滑膜肉瘤细胞体内的生长微环境。同时应用VEGF的成血管特性，刺激肿瘤内部微血管形成，为滑膜肉瘤的发生发展提供足够血运支持。应用Metrigel-VEGF-SW982细胞支架复合物制作滑膜肉瘤移植模型，提高了造模的成功率，同时也为其他软组织肿瘤以及造模成功率较低的肿瘤模型的建立提供了新的思路。

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