RUNX3基因对RAW264.7巨噬细胞极化的调控作用

李苏童，雷 洁，王娟红，王琦侠，申 远，姜小健，田普训

(1. 西安市中心医院肾病科，陕西西安 710003；2. 西安市中心医院病理科，陕西西安 710003； 3. 西安交通大学医学部统计教研室，陕西西安 710061；4. 西安市中心医院检验科， 陕西西安 710003； 5.西安交通大学第一附属医院肾脏病医院肾移植科，陕西西安 710061)

巨噬细胞作为重要的免疫细胞，广泛参与了机体免疫应答、炎症、组织重塑、衰老等多种病理生理过程，不同表型的巨噬细胞发挥不同的免疫学作用。既往研究已发现，巨噬细胞活化具有不均一性，可能有2种主要的极化模式：经典激活的巨噬细胞M1和替代激活的巨噬细胞M2。M1和M2在免疫过程中有不同的病理生理作用，可能通过巨噬细胞表面表达的一系列受体分子介导而发挥作用，其分子受体包括了活化性受体和抑制性受体[1]。转化生长因子(transforming growth factor β1, TGF-β1)通路广泛参与了巨噬细胞极化过程，而RUNX3是TGF-β1通路中的关键分子。RUNX3作为一种核转录因子，能够调节包括PIR-A/B在内的多种靶分子的转录与活化过程[2]。本研究通过沉默RAW264.7 RUNX3并检测细胞表面标志物和细胞分泌因子的变化，初步探讨RUNX3 在调节巨噬细胞极化状态中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 RAW264.7细胞系和mRTEC细胞系均购自武汉巴菲尔生物技术公司；胎牛血清购自Gibco公司；RPMI1640购自Gibco公司；羊抗鼠RUNX3多克隆抗体、兔抗鼠E-cadherin多克隆抗体、兔抗鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)多克隆抗体、羊抗鼠β-actin单克隆抗体(mAb)购于Sigma公司；CD86、arginase-1、iNOS抗体购自BD公司；HRP标记的抗兔IgG、HRP标记的抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。

1.2 RAW264.7细胞培养及刺激分化和检测

1.2.1 RAW264.7细胞培养及刺激分化 将RAW264.7(细胞数1×104)接种至6孔板，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液同步培养24 h，光学显微镜下观察照相；随机分为M1组、M2组及对照组(M0组)，每组3孔。M1组刺激分化采用先加入IFN-γ(100 u/mL)刺激20 h，再追加LPS(100 μg/mL)刺激6 h；M2组刺激分化采用加IL-4(20 μg/mL)刺激26 h；对照组不更换培养液，同步化培养26 h，收取各组细胞进行后续分组培养和检测实验。

1.2.2 诱导生成的M1和M2 RAW264.7巨噬细胞中RUNX3的检测 采用免疫荧光法检测。将1.2.1中各组细胞按1×104接种至24孔板，同步化培养2 h，室温PBS液洗涤2次，多聚甲醛(1 mL/孔)固定20 min，PBS洗5 min×3次；加PBST室温孵育10 min；PBS洗涤5 min×3次；50 mL/L牛血清封闭1 h；加入兔抗鼠RUNX3单克隆抗体(1∶100)湿盒4 ℃过夜；吸除一抗，PBS洗5 min×3次；加入山羊抗兔荧光二抗(1∶50)室温孵育1 h；PBS洗5 min×3次；加入DAPI (1 μg/mL)；避光5 min；PBS洗5 min×3次；抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜照相。

1.2.3 RT-PCR检测各组细胞RUNX3 mRNA的表达 分别提取各组(M1、M2、M0组)细胞RNA并进行RT-PCR检测。内参GAPDH引物分别为，正义5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′、反义5′-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′；RUNX3引物分别为，正义5′-GATGGCAGGCAATGACGA-3′，反义5′-TGCTGAAGTGGCTTGTGGT-3′，扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃变性5 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸12 s，45个循环。PCR产物进行分析。

1.2.4 RT-PCR检测M1组细胞iNOS和M2组细胞arginase-1 mRNA的表达 方法同1.2.3。iNOS引物分别为，正义5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCA-

GC-3′、反义5′-CCAAAGCCACGAGGCTCTGACAGCC-3′；arginase-1引物分别为，正义5′-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG-3′、反义5′-GGTGA-

CTCCCTGCATATCTG-3′。

1.3 siRNA载体的构建及质粒转染 根据GenBank已知人RUNX3 基因序列设计siRNA：TGACGAGAACTACTCCGCT。合成编码发夹结构siRNA，正义链RUNX3-F：5′-GATCCTGACGA-GAACTACTCCGCTTTCAAGAGAAGCGGAGT-AGTTCTCGTCATTTTTTGGAAA-3′，反义链RUNX3-R：5′-AGCTTTTCCAAAAAATGACGA-GAACTACTCCGCTTCTCTTGAAAGCGGAGT-

AGTTCTCGTCAG-3′。据此序列合成双链DNA，55 ℃退火，16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌，挑选菌落，碱裂解法提取质粒，进行酶切鉴定，扩增后得到重组质粒RUNX3-siRNA。

将正常培养的RAW264.7细胞(细胞数1×104)接种至6孔板，贴壁细胞达70%底板面积时进行转染。每孔加1 mL无血清DMEM，洗涤1次，弃去。100 mL无血清培养液稀释0.8～1.0 μg(6 μL)质粒作为空载体对照；100 mL无血清培养液稀释6 μL LipofectamineTM2000，室温下放置5 min后，将其与相应质粒混合，室温下放置30 min，将此混合物200 μL加入6孔板，每孔加入0.8 mL无血清培养液，培养6 h，每孔加入1 mL含250 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养24 h；然后加入G418选择性培养基(选用400 mg/L进行筛选)筛选转染克隆。沉默RUNX3基因的RAW264.7细胞系克隆株和正常培养的RAW264.7细胞分别命名为RAW264.7-siRUNX3和RAW264.7-cont，分别用RT-PCR法和Western blot检测RUNX3的表达情况以进行鉴定。RT-PCR方法同1.2.3；Western blot：用Bradford法测定各组蛋白浓度，每孔10 μL上样，100 g/L SDS聚丙酰胺凝胶电泳，半干法转至PVDF膜，丽春红染色标记，100 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，加50 g/L脱脂奶粉稀释的一抗(兔抗鼠RUNX3多克隆抗体，1∶200稀释)，4 ℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入50 mL/L脱脂奶粉稀释二抗(HRP标记的抗兔IgG，1∶400稀释)，室温孵育2 h，洗膜3次，ECL显影。

1.4 ELISA法测定细胞培养上清液中的TNF-α水平 收集RAW264.7-siRUNX3和RAW264.7-cont组细胞上清液，按照ELISA试剂盒操作说明，测定各组细胞TNF-α的分泌水平，全自动酶标仪在450 nm 处读取吸光度值。

1.5 RT-PCR法测定转染克隆中iNOS和CD86的mRNA表达 分别提取各转染组细胞RNA并进行RT-PCR检测。方法同1.2.3。CD86引物分别为，正义5′-TCAGTCAGGATGGGAGTGGTA-3′，反义5′-ATCCAAGAGCCATTCCTACCT-3′。

2 结 果

2.1 IFN-γ、LPS共刺激RAW264.7细胞iNOS的表达变化和IL-4刺激RAW264.7细胞arginase-1的表达变化 IFN-γ、LPS共刺激RAW264.7细胞24 h后提取总RNA，使用RT-PCR方法检测发现，与M0组(4.69±0.96)相比，M1组(1.13±0.25)iNOS表达明显减少(P=0.002)；而通过IL-4刺激RAW264.7细胞24 h后arginase-1表达升高，分别为M0组(2.09±0.2)，M2组(13.28±1.1) (P=0.021，图1)。这提示IFN-γ、LPS共刺激促进RAW264.7细胞向M1型巨噬细胞极化，而IL-4刺激RAW264.7细胞向M2型极化。

图1 INF-γ和LPS刺激或IL-4刺激RAW264.7细胞后iNOS和arginase-1的mRNA表达变化

Fig.1 The mRNA expressions of iNOS and arginase-1 in RAW264.7 cells stimulated by INF-gamma and LPS or stimulated by IL-4

与对照组(RAW264.7组)相比，*P<0.05。

2.2 各组细胞(M0、M1、M2)RAW264.7 RUNX3的表达

2.2.1 各组细胞RUNX3免疫荧光染色结果 荧光显微镜下观察到，M1组细胞呈多边形，触角较多，细胞较大；而M2组细胞较小，形状偏圆形，触角较少；RUNX3是一种核转录因子，主要表达于RAW264.7核膜部位；与M0组比较，M2组荧光较弱，而M1组荧光较强，并且M1组RUNX3荧光明显较M2组亮(图2)。

2.2.2 各组细胞RUNX3 mRNA的检测结果 与M0组(0.86±0.08)相比，M1组RUNX3 mRNA表达增高(1.16±0.37)(P=0.001)，M2组表达相比降低(0.53±0.1)(P=0.041)，而M1较M2组RUNX3 mRNA高表达(P<0.001，图3)。

2.3 RUNX3低表达细胞模型的建立 经过细胞转染和G418培养筛选，获得细胞系RAW264.7-siRUNX3和 RAW264.7-cont。PCR结果显示，RUNX3在RAW264.7-siRUNX3细胞中的表达(0.26±0.06)低于RAW264.7-cont组细胞(0.86±0.07)；Western blot检测结果显示，RUNX3在RAW264.7-siRUNX3细胞中的表达低于RAW264.7-cont组细胞(图4)。提示获得稳定转染的低表达RUNX3的RAW264.7 细胞系。

图2 M1型和M2型巨噬细胞RUNX3免疫荧光染色结果

Fig.2 RUNX3 immunofluorescence staining results of M1 and M2 macrophages (×400)

图3 M1型和M2型巨噬细胞RUNX3 mRNA的表达

Fig.3 RUNX3 mRNA expressions in M1 and M2 macrophages

RUNX3 mRNA水平在M1中表达最高(P=0.001)，M0中表达水平次之，而M2中表达最低(P=0.041)，差异均具有统计学意义。

图4 PCR和Western blot检测RUNX3-siRNA转染后RAW264.7中RUNX3的mRNA(A)和蛋白(B)表达

Fig.4 mRNA and protein expressions of RUNX3 in RUNX3-siRNA transfected RAW264.7 detected by PCR (A) and Western blot (B)

与RAW264.7-cont组比较，P<0.05(P=0.036)。

2.4 RAW264.7-siRUNX3抑制RAW264.7细胞 iNOS和CD86 mRNA表达 RAW264.7-siRUNX3组iNOS(0.61±0.13)较RAW264.7-cont表达降低(2.96±0.19)(P<0.001)；CD86 mRNA表达(0.67±0.09)较RAW264.7-cont组降低(4.72±0.38)(P=0.005，图5)。

图5 RAW264.7-siRUNX3抑制RAW264.7 iNOS(A)和CD86(B)mRNA的表达

Fig.5 RAW264.7-siRUNX3 inhibited the mRNA expressions of RAW264.7 iNOS (A) and CD86 (B)

与RAW264.7-cont组相比，RAW 264.7-siRUNX3组细胞iNOS(P<0.001)和CD86(P=0.005)表达明显下降，差异具有统计学意义。

2.5 RUNX3低表达RAW264.7分泌的TNF-α变化 与RAW264.7-cont组(55.11±4.32)相比，RAW264.7-siRUNX3组培养液中TNF-α含量(34.8±4.29)较低(P<0.001，图6)，这说明RUNX3低表达抑制了TNF-α的分泌。

3 讨 论

巨噬细胞是具有高度异质性的固有免疫细胞，其激活形式多种多样，称为巨噬细胞极化(polarization)，不同极化方式的巨噬细胞发挥着完全不同的免疫学作用。现有的研究将巨噬细胞分为经典活化型(M1)和选择活化型(M2)。在不同的微环境下M0可分化成为M1或者M2，发挥不同的免疫作用。M1型巨噬细胞吞噬细菌，释放炎症因子，促进炎症反应发生；而M2型巨噬细胞抑制炎症，促进组织修复。不同的信号通路以及多种信号转导因子、转录活化因子、干扰调节因子、核因子、激活蛋白等都参与了巨噬细胞极化过程。近些年的研究证实Wnt信号通路除了在传统胚胎发育和内环境稳定中发挥重要作用以外，还参与了多种炎症性疾病的免疫调节[3]。Wnt信号通路同样也参与了巨噬细胞极化过程，研究结核病的学者们发现Wnt6上调能够促进巨噬细胞向M2方向极化[4]；而Wnt5a低表达也能够促进巨噬细胞向M2方向极化[5]。动物来源的原代巨噬细胞增殖困难，不利于进行基因敲除等实验研究，因此，本研究选用巨噬细胞细胞系RAW264.7作为分子生物学研究对象，并在实验中证实了IFN-γ和LPS刺激促进RAW264.7细胞向M1亚型极化，而IL-4促进RAW264.7细胞向M2亚型极化，这与其他学者的研究结果相符合。

图6 RUNX3低表达抑制RAW264.7 TNF-α分泌

Fig.6 The low expression of RUNX3 inhibited the TNF-α secretion in RAW264.7

与RAW264.7-cont比较，*P<0.001。

RUNX3属于转录因子中runt结构域家族，是一种器官组织发育过程中重要的核转录因子；RUNX3能够调控多种基因表达，并且参与了Wnt信号通路调节过程。在胃癌相关的研究中，有学者认为RUNX3能够通过调控TCF4/β-catenin结合而正向或者负向调控Wnt通路激活[6]。本研究通过免疫荧光实验直观观察到RUNX3在RAW264.7刺激极化形成的M1和M2细胞中表达的强弱不同，而通过RT-PCR的定量结果，也证实了RUNX3在RAW264.7刺激极化形成的M2细胞中表达高于M1。PIR-B是RUNX3的靶分子之一，在B淋巴细胞中，RUNX3和PU.1共同调控B细胞表面PIR-B受体的表达；PIR-B是表达在多种免疫细胞表面的抑制性受体。研究证实，M1型巨噬细胞表面PIR-B受体表达显著降低，而M2型巨噬细胞表面PIR-B受体

表达明显增高[7]；另有研究证实RUNX3在巨噬细胞极化的过程中调节粘附分子的表达[8]；而TGF-β、Wnt通路明确参与了巨噬细胞极化过程，而RUNX3与巨噬细胞极化是何种关系尚不清楚。对此，本研究敲除了RAW264.7巨噬细胞的RUNX3基因，建立了RUNX3低表达细胞模型，通过RT-PCR发现在RAW264.7细胞表面M2型巨噬细胞的表面标记分子iNOS和CD86 mRNA表达有所下降；虽然与对照组相比TNF-α的分泌量显著下降，但仍有部分分泌量，这表明，敲除了RUNX3的巨噬细胞有向M1方向极化的趋势，RUNX3可能部分参与了巨噬细胞极化的过程。不同类型的巨噬细胞在纤维化消解、创伤修复、移植免疫排斥、炎症反应等多种病理生理过程中发挥着截然不同的重要作用，调节巨噬细胞极化是治疗脏器纤维化、创伤修复、自身免疫性及炎症性疾病新的重要切入点，本研究为这些疾病治疗提供了可能的新靶点。

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