肠系膜淋巴管结扎对脓毒症相关肺脏损伤及 肠道损伤的作用

张靖垚，毕建斌，刘苏顺，庞 青，刘 昌

(西安交通大学第一附属医院：1. 肝胆外科；2. 外科ICU，陕西西安 710061)

脓毒症(sepsis)常常继发于烧伤、外伤、手术创伤、休克及感染等临床情况，早期得不到及时妥善处理，进一步发展可导致多器官功能障碍综合征(MODS)甚至死亡[1]。肠道是大多腹腔感染所致脓毒症的始动器官，肠壁的缺血、缺氧及再灌注损伤，可以导致肠道屏障的破坏，进而引起肠道菌群移位及内毒素扩散，通过血液系统、淋巴系统、直接扩散等途径引起菌血症，最终导致全身感染[2-3]。肺脏因其特殊解剖结构，毛细血管网丰富，成为脓毒症最易受损的器官，早期即可出现急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)[4]。近年来随着科技的发展及医疗进步，对于脓毒症的认识越来越深入，但是针对脓毒症的治疗尚未取得突破性进展，因此寻找新的或者辅助的临床治疗手段非常重要。已有研究表明，肠淋巴途径在MODS中发挥重要作用，阻断休克时肠淋巴液回流可减轻大鼠肺、心、肾、肝等重要器官的炎症反应及器官损伤程度[5]；也有研究发现，肠系膜淋巴管结扎(mesenteric lymph duct ligation, MLDL)可以减轻休克大鼠的肝损伤[6]；最新的研究也表明其对热射病所致的肺损伤有保护作用[7]。但是MLDL在脓毒症所致的器官损伤中的作用尚未见报道。本研究即重点探讨MLDL后阻断肠淋巴液回流对盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)所致大鼠脓毒症的肺脏及肠道损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级Sprague Dawley雄性大鼠45只，购自西安交通大学医学部动物实验中心，体质量220～260 g。本研究将实验大鼠随机分为假手术对照组(Sham组，n=15)、脓毒症组(CLP组，n=15)和MLDL组(CLP+MLDL组，n=15)。各组大鼠于CLP造模24 h后再次使用戊巴比妥钠全身麻醉，开腹游离腹主动脉并采集动脉血进行相应指标检测；同时收集距离回盲部约10 cm处的近端回肠组织及肺脏组织，行相应的病理及生化指标检测。

1.2 模型制备及干预

1.2.1 脓毒症大鼠模型的制备 采用CLP法建立脓毒症大鼠模型[8]：腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠50 mg/kg 麻醉大鼠后，沿腹部正中线切3 cm长切口，开腹、暴露盲肠，在距盲肠根部1/2处结扎盲肠，用21G针头穿刺盲肠1次，挤出少量肠内容物，还纳盲肠并缝合切口。Sham组只开腹进行盲肠探查、不结扎穿孔，术后给予大鼠皮下注射生理盐水30 mL/kg 补液；MLDL组于CLP造模时行MLDL操作；CLP组于CLP造模时暴露肠系膜淋巴管(mesenteric lymph duct, MLD)，未予结扎，术后给予等量液体补液。

1.2.2 MLDL处理 腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠后，沿腹部正中线切3 cm长切口，打开腹腔，轻轻推开肠管，暴露肠系膜根部，游离肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)，仔细分离与SMA相伴行的MLD，在MLD下穿线结扎[9]。

1.3 肺泡灌洗液的收集 根据刘彦[10]的报道采用在体全肺肺灌洗法收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)。将7号塑料输液管的针头端剪掉，留出约3 cm长的一段输液管，将该段输液管的一端套在5 mL注射器上，暴露大鼠气管，在气管上剪一小切口，将输液管插入气管腔内，并用缝线固定。将2 mL、37 ℃无菌生理盐水缓慢注入肺内，间隔30 s后，将其抽回，如此进行3次，共收集到BALF约5 mL，1 500 r/min、4 ℃离心10 min，将离心沉淀的细胞团用0.3 mL生理盐水悬浮，制成细胞悬液。

1.4 动脉血气分析 将收集的动脉血采用ALB5型全自动血气分析仪检测动脉血氧分压(PaO2)。

1.5 肺脏及肠道组织的HE染色 将部分切取的肺脏及回肠组织，用40 g/L中性甲醛固定，进行常规HE染色，在光学显微镜下进行病理组织学观察。

1.6 急性肺损伤(ALI)评分及肠道Chiu’s评分 根据FALLER等[11]的方法评估大鼠的ALI评分及CHIU等[12]的方法评估大鼠的肠道损伤。

1.7 BALF中炎症因子、细胞及总蛋白水平的检测 根据ELISA检测试剂盒说明书指示，测定BALF中TNF-α、IL-6及总蛋白的含量；用Neubauer Chamber

方法测定BALF中细胞总数及分类[13]。

1.8 血液D-乳酸的检测 根据ELISA检测试剂盒说明书指示，测定血液中D-乳酸含量。

1.9 肠道组织二胺氧化酶(DAO)的检测 根据南京建成购买的生化试剂盒说明书指示，检测肠道组织DAO的含量。

1.10 细菌负荷实验 取血液组织(1 mL)、肺脏(1 g) 及回肠组织(1 g)称重切碎后再匀浆，加9 g/L生理盐水连续稀释成不同倍数的稀释液，取各种不同倍数的稀释液分别定量滴入血琼脂培养基内，37 ℃培养24～48 h，采用平板活菌计数法读出菌落数，并根据组织重量和稀释倍数计算出每毫升组织悬液中的细菌数。

2 结 果

2.1 MLDL减轻脓毒症大鼠的肺损伤 CLP造模后的脓毒症大鼠可表现出不同程度的精神差、毛发湿冷倒立、反应迟钝、活动减少以及脱水等临床表现。在大鼠麻醉恢复后，经过MLDL处理的大鼠可更快地从脓毒症打击中恢复，其活动能力明显强于CLP组大鼠。大鼠肺脏组织的HE染色可见，CLP组大鼠肺组织内可见大量肺泡组织破裂、结构紊乱，大量炎性细胞浸润，肺实变严重；MLDL组大鼠肺组织内则可见少量炎性细胞浸润，散在的肺泡壁充血、增厚，但肺实变明显减轻，肺泡组织结构较完整(图1A)。血气分析结果显示，MLDL可明显改善脓毒症大鼠的氧合状况，提升PaO2(图1B)；通过统计各组大鼠的肺脏湿/干比，提示MLDL可以减轻脓毒症时肺水肿、出血及充血情况(图1C)。综合各组大鼠临床及病理学特点，计算ALI评分，发现MLDL可以明显降低脓毒症大鼠的肺损伤评分(图1D)。

图1 MLDL对脓毒症大鼠肺损伤的影响

Fig.1 Mesenteric lymph duct ligation (MLDL) alleviated sepsis-induced lung injury in rats

A：大鼠肺脏组织的HE染色；B：PaO2水平；C：肺脏湿/干比；D：ALI评分。Sham：假手术对照组，CLP：脓毒症组，CLP+MLDL：MLDL处理组。与CLP组比较，*P<0.05。

2.2 MLDL降低脓毒症大鼠BALF中炎症因子、蛋白及细胞外溢水平 CLP造模24 h后收集各组大鼠的BALF，首先通过ELISA方法检测了炎症因子TNF-α和IL-6的水平，评估肺部局部炎症水平。结果显示，MLDL可以明显减少BALF中TNF-α和IL-6的水平(图2A、2B)。检测灌洗液中细胞及蛋白的水平，以评估肺泡的渗出情况，结果显示，MLDL可以明显减少BALF中细胞总数及总蛋白水平(图2C、2D)。

2.3 MLDL对脓毒症大鼠肠道无明显保护作用 大鼠处死后取距离回盲部约10 cm处的回肠组织行HE染色，结果显示，CLP组大鼠小肠绒毛结构破坏明显，炎性细胞大量聚集在黏膜及黏膜下层，而MLDL处理组大鼠的小肠组织病理与CLP组未见明显异常(图3A)。通过计算大鼠Chiu’s评分(图3B)，检测血液D-乳酸(图3C)及肠道组织DAO的水平(图3D)，结果表明MLDL对脓毒症大鼠的肠道损伤无明显保护作用。

图2 MLDL对脓毒症大鼠肺泡灌洗液中的炎症因子(A、B)、细胞总数(C)及蛋白水平(D)的影响

Fig.2 Mesenteric lymph duct ligation (MLDL) decreased bronchoalveolar lavage fluid (BALF) inflammatory cytokines, total cells and protein levels in septic rats

Sham：假手术对照组，CLP：脓毒症组，CLP+MLDL：MLDL处理组。与CLP组比较，*P<0.05，#P<0.01。

图3 MLDL对脓毒症肠道损伤的影响

Fig.3 Mesenteric lymph duct ligation (MLDL) had no effect on sepsis-induced intestinal injury in rats

A：回肠组织的HE染色结果；B：Chiu’s评分；C：D-乳酸水平；D：DAO水平的影响。Sham为假手术对照组，CLP为脓毒症组，CLP+MLDL为MLDL处理组。

2.4 MLDL降低脓毒症大鼠血液及肺脏组织的细菌负荷，但对肠道中的细菌水平无明显影响 CLP造模24 h后收集各组大鼠的血液、肺脏及肠道标本，制成10%的匀浆后检测上述3种组织中的细菌负荷水平。结果显示，MLDL可以明显降低脓毒症大鼠血液及肺脏组织中的细菌负荷水平，但是对大鼠肠道组织的细菌水平则无明显影响，甚至有加重细菌负荷趋势(图4)。

图4 MLDL对脓毒症大鼠血液、肺脏及肠道组织细菌负荷的影响

Fig.4 Effect of mesenteric lymph duct ligation (MLDL) on bacterial load of the blood, lung and intestines

CLP为脓毒症组，CLP+MLDL为MLDL处理组，血液(blood)、肺脏(lung)及肠道(intestine)。*P<0.01。

3 讨 论

脓毒症是感染引起的宿主反应失调所致的致命性器官功能障碍，是感染诱发的全身机体生理、病理及功能的异常综合表现，全球每年约有数百万人患脓毒症，近年来越来越受到临床医生及科学家的关注[1,14]。脓毒症时致病因子可激活炎症细胞产生、表达和过度释放细胞因子和炎症介质，启动炎症瀑布连锁反应，通过激活中性粒细胞、损伤内皮细胞，释放氧自由基、脂质代谢产物及溶酶体酶，引起机体微循环障碍、凝血机制紊乱及细胞凋亡等机体病理变化[15]。腹腔感染所致脓毒症时，由于肠屏障功能损伤、肠源性内毒素血症和肠道细菌移位，可引起远隔器官如肺脏、肝脏、心脏等的功能损害。肠道屏障功能障碍致肠道内细菌/内毒素移位(bacteria/endotoxin translocation, BET)所引起的肠源性感染，是脓毒症发展为MODS的始动环节[16-17]。

随着学者们对肠源性BET的肠淋巴途径研究逐渐深入，发现肠淋巴液回流在脓毒症进展中的重要作用，深入揭示其作用机制成为危重病医学领域的研究热点[18]。腹膜组织存在丰富的毛细淋巴管网，脏层腹膜，尤其是消化管表面的毛细淋巴管和淋巴管网共同形成淋巴管丛，发出集合淋巴管注入局部淋巴结，MLD是一个主要的流出通道。在脓毒症情况下，腹腔内脏器所吸收的有害物质及细菌也会通过MLD转运。研究证实，腹膜的毛细淋巴管对一些大分子物质具有一定的吸收作用[19]。本研究表明，脓毒症大鼠的肺损伤(肺脏病理、PaO2，肺脏湿/干比、肺泡灌洗液中的炎症因子、细胞及蛋白外溢)显著重于Sham组，但MLDL组大鼠的上述指标均显著轻于CLP组，提示MLDL使淋巴液断流，可以减少甚至抑制腹腔内的细菌及内毒素进入淋巴循环，对肺脏功能具有一定的保护作用。

同时，肠道是腹腔感染所致脓毒症时TNF-α的重要细胞来源。内毒素刺激肠黏膜肥大细胞释放大量的TNF-α，进而可以激活补体及巨噬细胞，释放大量的炎症介质和细胞因子，如IL-6及IL-8等，启动免疫细胞、细胞因子、炎症介质所构成的炎性反应系统和细胞因子网络，促进全身炎症反应综合症MODS的发生[16]。本研究结果显示，MLDL组肺泡灌洗液中的TNF-α及IL-6水平均明显低于CLP组，其原因，一方面可能是MLDL可以“直接”阻断并减少了脓毒症时炎症因子从淋巴途径向肺脏的扩散；另一方面，也可能是对“因肠道向肺脏扩散的细菌及毒素引起的肺损伤”所致的继发炎症反应的抑制作用。由于微淋巴管具有主动吸收大分子物质的功能，结扎肠系膜淋巴管可能阻断了TNF-α等细胞因子及炎症介质自腹腔及肠的吸收和转运。通过对肺脏组织的通透性检测，MLDL也可以减轻肺部损伤时的通透性，综合考虑，这种“减轻通透性的作用”可能是继发于减少了脓毒症时肺部的细菌感染时造成的损伤，为一个“继发性”保护作用。总的来说，MLD对于肺脏的保护作用，其“直接”机制为减少了脓毒症时腹部细菌往肺部的扩散，“间接”机制为减轻了肺部的炎症及肺泡通透性。

然而，通过对肠道的病理学以及屏障功能相关的指标检测，发现MLDL对其无保护作用，这一点与之前研究结果不同。我们又检测了血液、肺脏及肠道组织内的细菌水平，发现MLDL可以减少血液及肺脏等“远隔脏器”的细菌含量，但是肠道内的细菌水平无明显变化，甚至有增加的趋势，我们考虑结扎MLD可以阻断来自肠道及腹膜的淋巴流，使得脓毒症产生的有害物质及细菌，难以轻易地经MLD播散全身，但是这些被阻断的有害物质可能会在肠道及肠系膜淋巴结内积聚，进而引起甚至加重肠道损伤。

淋巴学研究虽然在组织液回流、维持体液稳态、机体免疫、肿瘤转移及淋巴水肿等方面有了很大进展，但和血液学相比，淋巴学的基础理论和临床应用研究长期以来发展甚为缓慢[19-20]。本研究结果表明，淋巴微循环在脓毒症的发病过程中有重要作用，MLDL可阻断细菌经肠系膜淋巴液运输，有效地降低炎症因子及细菌往肺部的释放，对脓毒症大鼠的肺损伤有显著的保护作用，减轻肺脏的功能障碍和形态损伤。但是其对于肠道损伤的作用则可能需要进一步的研究，因为目前的研究结果表明这种操作甚至可能会加重肠道的损伤，加重细菌在肠道组织内的积聚。因此，需要综合考虑此种手术操作的利弊，如何能规避肠道损伤是下一步研究的重点及难点。

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