miR-29、miR-200a在妊娠期糖尿病者外周血中表达及临床意义

倪 雯 刘 佳 张弘雎

1.济南军区总医院原北陆参谋部门诊部(250002)；2.山东省淄博市妇幼保健院

妊娠期糖尿病(GDM)是临床产科较为常见的一种妊娠并发症，增加不良妊娠结局的发生风险，严重危害母婴健康[1]。发病机制尚未完全明确，临床诊断需在孕中期检测血糖予以判定，若能在早孕期利用相关生物学标志物预测或诊断GDM，将为GDM治疗与改善新生儿预后带来裨益。微小RNA(miR)是一类小的非编码RNA，主要参与mRNA转录后调控，其在胎盘发育、细胞分化、细胞黏附、细胞转移、细胞凋亡、血管生成等方面发挥着至关重要的作用[2]。近年来，妊娠相关疾病与外周血中miR表达失调的相关性研究已成为临床热点。近期有研究提出[3]，miR-200a可经Trp53/Bax信号通路促进胰岛β细胞凋亡，进而引起2型糖尿病，miR-29在血糖诱导的胰岛素分泌与胰岛素抵抗中发挥着重要作用，但miR-200a、miR-29与GDM的关系尚不清楚。为明确miR-29、miR-200a在GDM患者外周血中的表达特征及临床意义，本文进行对照研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院产科在2016年5月—2018年5月接诊的GDM患者作为观察组。另选取本院产科同期接诊的糖耐量正常孕妇作为对照组。诊断依据国际妊娠与糖尿病研究组织制定的2015妊娠期糖尿病筛查指南[4]：①孕前体质指数(BMI)>24kg/m2；②既往有糖耐量异常史或糖尿病家族史；③既往存在流产、子痫前期、羊水过多、胎儿畸形、难产、死胎、死产史；④妊娠期间有胎儿过大、羊水过多等表现；⑤伴有反复假丝酵母菌感染；⑥受孕早期有尿糖表现。上述高危孕妇均在早孕期进行糖耐量试验，低危孕妇则在孕24～28周进行糖耐量试验，并结合空腹血糖、餐后2h血糖指标予以判定。2次测得的空腹血糖均≥7.0mmol/L，或随机血糖≥11.1mmol/L，或75g OGTT试验显示空腹及服糖后1h、2h、3h血糖葡萄糖值中至少有两项达到5.3mmol/L、10.0mmol/L、8.6mmol/L、7.8mmol/L即可诊断为妊娠期糖尿病。观察组患者符合GDM诊断标准，对照组经OGTT筛查显示糖耐量正常。同时排除年龄<18岁；合并妊娠期高血压疾病；合并其他内科疾病；孕期接触过有害物质；脐带或胎盘异常；母婴血型不合；多胎妊娠。所有入组对象均在本院产科住院分娩。

1.2 方法

1.2.1仪器与试剂电化学发光法胰岛素检测仪、全自动生化分析仪(美国Beckman公司生产)；PCR扩增仪(美国PE公司生产)；AM1560 RNA抽提试剂盒(美国Ambion公司生产)；TaqMan反转录试剂盒(美国APPS公司)。

1.2.2标本采集与检测两组研究对象均采集空腹静脉血8ml，分装于两支试管中。一支试管使用EDTA抗凝保存，用于提取血清RNA；另一支试管用于检测空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbAlc)水平。采血后口服葡萄糖液，服糖2h后再次采集静脉血，用以检测2hPG水平。①miR-29、miR-375、miR-200a检测：按照试剂盒说明书抽提血清RNA并放置于-80℃冰箱保存。在16℃、42℃、85℃、4℃环境下各逆转录反应30min、30min、5min、5min，在95℃环境下行RT-PCR反应10min，45个循环的95℃反应15s，60℃反应60s。以U6 SnRNA为内参照，使用SDS1.4软件计算Ct值，相对于U6 SnRNA的2-ΔΔCt为目的miRNAs的相对表达量。②FINS、FPG检测：使用电化学发光法胰岛素检测仪测定FINS、FPG、2hPG、HbAlc值。

1.3 观察指标

①比较两组FINS、FPG、2hPG、HbAlc检测值；②对比两组的miR-29、miR-375、miR-200a表达量；③分析外周血miR-29、miR-375、miR-200a表达与FPG、2hPG、HbAlc、FINS的相关性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 研究对象一般资料

观察组80例，年龄(28.5±4.4)岁(20～39岁)，分娩孕周(39.3±0.7)周(38～41周)，BMI(23.5±2.4)kg/m2(20～26kg/m2)；对照组80例，年龄(27.8±3.6)岁(19～40岁)，分娩孕周(39.5±0.2)周(39～42周)，BMI(24.61±3.04)kg/m2(22～27kg/m2)。两组资料比较无差异(P>0.05)。

2.2 两组对象血糖检测比较

观察组FINS水平低于对照组，FPG、2hPG、HbAlc水平高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.3 两组对象外周血基因表达量比较

观察组外周血miR-29表达量低于对照组， miR-375、miR-200a表达量均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表1 两组血糖检测结果比较

表2 两组外周血基因表达量比较

2.4 外周血基因表达与血糖指标相关性分析

相关性分析显示，miR-29表达的ΔCt值与FPG、2hPG、HbAlc均呈正相关，与FINS呈负相关(P<0.05)；miR-375、miR-200a表达的ΔCt值均与FPG、2hPG、HbAlc呈负相关，与FINS呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 外周血miR-29、miR-375、miR-200a表达与血糖指标的相关性

3 讨论

目前，临床已有多种GDM预防手段，但总体效果并不满意，多数GDM患者都是在孕中期才被发现，少数患者确诊时甚至已处于孕晚期。GDM发现得越晚，对孕产妇及围生儿的危害越大，而早期诊断GDM能够尽早采取干预措施，稳定地控制血糖，对于改善母婴预后具有重要作用。

目前已有研究证实在多种疾病的发生、发展过程中均有miRNA的参与，如自身免疫疾病、神经系统疾病、心血管疾病、2型糖尿病、肿瘤等，故临床可将外周血中的miRNA作为预测相关疾病的生物学标志物[5]。近期有文献报道[6]，在GDM的发生、发展过程中均有miRNA的参与。miRNA在人体细胞、组织的生长发育过程中发挥着至关重要的作用，高糖、高脂环境会对miRNA表达产生影响，所以miRNA表达异常可在一定程度上反映机体的高糖、高脂状态。人类血清中的miRNA种类繁多，不同的miRNA都具有较高的疾病特异性与稳定性，将其作为预测各种疾病预后的标志物有较高的可靠性。

近期有研究发现，miRNA与胰岛素的生成、分泌、作用以及胰岛发育均有着密切联系。miRNA在人体血液、血清中有高度的稳定性， miRNA检测具有准确、微创等优点，所以越来越多的学者认为可将其作为糖尿病发病机制的靶点与诊断标志。miR-375主要由胰岛β细胞表达，其能通过控制肌营养素水平来调节胰岛素分泌。miR-29在血糖刺激的胰岛素分泌与胰岛素抵抗中发挥着关键性作用。动物实验模型[7]显示自发性糖尿病大鼠的miR-29表达水平显著高于正常大鼠，而在自发性糖尿病大鼠的脂肪组织3T3-L1细胞系中检测到了过表达的miR-29。miR-29的过表达会抑制胰岛素激发的葡萄糖摄取能力，降低细胞对胰岛素的敏感性，其与高胰岛素、高血糖引起的胰岛素失敏原理基本相同。据一项文献报道显示[8]，16～19孕周的GDM患者外周血miR-132、miR-222、miR-29a表达均显著低于正常孕妇，提示miRNA可作为评估GDM的无创血清学标记物。

本次研究结果显示，观察组的FINS水平显著低于对照组，FPG、2hPG、HbAlc水平显著高于对照组，说明GDM的发生与β细胞功能下降导致的胰岛素分泌减少有关。观察组外周血miR-29表达量显著低于对照组， miR-375表达量显著高于对照组。这一结果与前述两篇动物实验研究结论相符，说明miR-375可调低PDK1表达，影响葡萄糖对胰岛素基因表达的刺激能力，影响DNA合成，进而引发严重糖尿病。miR-375的高表达可促使胰岛β细胞凋亡，miR-29的低表达则能通过抑制胰岛β细胞分化、成熟来破坏胰岛素分泌功能。在miR-29与miR-375表达异常的共同作用下，使胰岛β细胞数量明显减少，削弱胰岛β细胞功能，进而引发GDM。miR-200是miRNA家族的重要成员，miR-200a是miR-200家族的成员之一，近年来关于miR-200a表达与糖尿病相关性的研究越来越多。国内有研究显示，与正常孕妇相比，GDM患者胎盘及外周血中的miR-200a表达均明显增加，且胎盘与外周血中的miR-200a表达水平接近。但也有研究显示，16例孕16～19周GDM患者外周血中的miR-200a表达与正常孕妇接近。本次研究结果显示，观察组外周血中的miR-200a表达量显著高于对照组，与前述研究结论不符，可能是因为前述研究选取的GDM样本含量较小和检测时间较早，而本次检测时间多为孕晚期，提示miR-200a表达的升高在孕晚期表现更为明显。本文相关性分析显示，miR-29、miR-375、miR-200a表达的ΔCt值与FPG、2hPG、HbAlc、FINS均显著相关，说明miR-29、miR-375、miR-200a异常表达均与GDM易感性密切相关。

综上所述，外周血中miR-29、miR-200a、miR-375表达均血糖相关指标密切相关，miR-29、miR-200a、miR-375表达异常预示着GDM易感性。临床可通过测定孕妇外周血miR-29、miR-375表达为临床早期诊断GDM提供一定的参考依据，而miR-200a可能在孕晚期增加明显，其对早期GDM的预测价值还有待进一步考证。