骨髓间质干细胞静脉注射移植对大鼠脊髓损伤后NGF及TNF-α表达的影响

陈荣生 王长昇 许卫红

(福建医科大学附属第一医院脊柱外科，福建 福州 350005)

脊髓损伤(SCI)是指脊髓由于各种外力作用下(车祸、坠落伤、火器伤等)造成的脊髓某一处受损，导致相应的感觉与运动平面神经功能障碍，是一种严重的致残性损伤，往往造成不同程度的瘫痪〔1,2〕。SCI的治疗主要包括药物治疗、外科手术及后期的康复训练，由于损伤后神经功能恢复比较困难。因此，SCI再生修复技术一直是骨科及神经科研究领域的热点。近年来，随着细胞移植及神经组织工程等技术的发展，利用骨髓间质干细胞(MSCs)移植治疗SCI，为SCI的治疗开辟了一条新途径〔1～3〕。大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)具有自我复制和多向分化潜能等特点，选择大鼠作为SCI的模式动物，受到国内外学者的广泛认可。实验已发现，rMSCs移植治疗SCI取得了较为显著的疗效〔2，3〕，但其具体的作用机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨MSCs移植治疗SCI的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1实验试剂与材料 RNA提取所用Trizol(Invitrogen，美国)，反转录试剂盒(Roche，瑞士)，PCR所用酶购自Takara(日本)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2实验动物与分组 2～3月龄清洁级雄性健康SD大鼠90只，由本院实验动物中心提供，体重170～280 g。其中制作SCI模型84只，随机分为对照组和 rMSCs移植组各42只，剩下6只作为假手术组。

1.3rMSCs的制备 将5只SD大鼠麻醉，消毒，取四肢骨，暴露骨髓腔，用 10 ml含肝素的培养液冲洗骨髓腔至试管内，加入Ficoll-Paque分离液，梯度离心，吸取富含粒细胞层，PBS洗涤2次。加入含20%胎牛血清(FBS)的AMEM培养液，移液器吹打成单细胞悬液，转移至培养瓶中，于37℃，5%CO2的条件中无菌培养。

1.4SCI动物模型建立与处理 采用改良Allen重物打击法制作SCI模型〔4〕：首先将大鼠麻醉，俯卧位固定于手术台上，背部备毛，暴露T10棘突。准备打击装置整合于立体定位仪上，垫片置于暴露的T10脊髓表面，打击装置自由落下打击该垫片，造成脊髓冲击伤。在撞击脊髓的瞬间，大鼠双下肢迅速弹动，身体抖动，打击部位呈瘀紫色，术后双下肢完全瘫痪，表明造模成功。假手术组仅暴露脊髓，而不进行脊髓冲击伤。对照组静脉注射PBS 1.0 ml，假手术组、rMSCs移植组静脉注射1.0 ml含1×106个rMSCs的单细胞悬液。

1.5RNA提取和RT-PCR实验 于损伤后1、6、12、24、72、168、336 h，对照组和rMSCs移植组(n=6)取样，提取RNA。所有接触RNA的试剂、枪头、塑料容器、玻璃器皿均经0.1% DEPC水处理后，高压蒸汽灭菌。用Trizol试剂提取细胞总RNA。取1.0 μg RNA，根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录。设计特异性PCR引物，对NGF及TNF-α进行扩增。引物序列分别为：NGF正义：5′-AGCCTCCTCTGCTCTTTCTGCTGGA-3′，反义：5′-CTTT′GTCTATGCCCCTGCAGCCTT-3′。TNF-α正义：5′-CGAGTGACAAGCCTGTA-3′，反义：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。β-actin正义：5′-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3′，反义：5′-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3′。PCR程序设置如下：95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，30 s；共35个循环，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳(Bio-rad，美国)后凝胶成像系统(Bio-rad，美国)扫描图象并分条带析灰度值。根据得到的灰度值，进行灰度分析，目的基因的灰度值与内参基因灰度值的比值即为该目的基因相对表达量，以(NGF/β-actin)%或(TNF-α/β-actin)%表示。

1.6统计学方法 应用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1NGF mRNA的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析 以各组逆转录得到的cDNA为模板，利用NGF特异性引物或内参β-actin引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，结果发现：β-actin出现与预期大小一致的特异性扩增带(607 bp)，NGF扩增后也出现与预期大小一致的特异性扩增带(467 bp)，且各个时间点均能扩增出特异性产物。

2.2NGF在各组处理前后的表达水平 假手术组中NGF相对转录水平为(0.417±0.114)，对照组和rMSCs移植组NGF在损伤后1 h表达即显著升高，且rMSCs移植组较对照组升高更明显(P<0.05)；对照组和rMSCs移植组均于损伤后72 h升至高峰，随后开始下降，对照组下降趋势更为明显，至损伤后336 h两组NGF表达水平仍明显高于假手术组水平(P<0.05)； rMSCs移植组各时间点的NGF表达水平均显著高于对应时间点的对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组NGF相对转录水平

与假手术组比较：1)P<0.05；与对照组比较：2)P<0.05；与前一时间点比较：3)P<0.05;下表同

2.3TNF-α mRNA的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析 以各组逆转录得到的cDNA为模板，利用TNF-α特异性引物或内参β-actin引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，结果发现：β-actin出现与预期大小一致的特异性扩增带(607 bp)，TNF-α扩增后也出现与预期大小一致的特异性扩增带(363 bp)，且各个时间点均能扩增出特异性产物。

2.4TNF-α在各组处理前后的表达水平变化 假手术组TNF-α相对转录水平为(0.067±0.103)，对照组和rMSCs移植组损伤后1 h TNF-α表达升高，于损伤后6 h升至高峰，之后呈下降趋势，rMSCs移植组下降趋势更为明显(P<0.05)；对照组损伤后336 h基本恢复至假手术组水平，rMSCs移植组损伤后168 h即恢复至假手术组水平； rMSCs移植组损伤后6、12、24、72、168 h时间点的TNF-α表达水平低于对应时间点的对照组(P<0.05)。见表2。

表2 各组TNF-α相对转录水平

3 讨 论

近年来的研究发现神经干细胞在中枢神经系统损伤性疾病中具有神经再生、修复功能，引起众多研究者的兴趣〔5〕。MSCs具有自我更新和多向分化等特点，具有很多其他来源的细胞所不具备的优势，如：无免疫活性，取材相对方便、可从患者自身骨髓取材，可进行基因改造等〔6〕。因此，MSCs是移植治疗的理想细胞来源，利用MSCs移植治疗SCI，为SCI的治疗开辟了一条新途径。

SCI是一种比较严重的神经创伤，研究发现NGF在SCI恢复过程中发挥重要作用〔7,8〕。NGF是一种分布于动物体内的多肽类物质，能够对损伤神经进行营养修复及促进再生〔9〕。本研究发现，NGF在正常大鼠脊髓仅轻微表达，SCI后NGF表达明显增加。可以推测，SCI后NGF表达增加，是神经元自我保护作用的一种反应，但是这种自我保护、修复能力随时间延长而减弱；而rMSCs移植组可以继续维持高水平的NGF表达，从而支持神经元的修复、再生。NGF mRNA于损伤后1 h即开始升高，提示NGF可能在SCI的早期发挥SCI修复的作用。

研究发现，TNF-α在急性SCI后炎症反应的发生中发挥着重要的作用〔10〕。炎症因子TNF-α作为其他炎性因子的启动因子，可以促进其他炎性因子的产生，参与损伤区炎症级联反应。TNF-α 在促进脊髓继发性损伤中也起着重要作用。神经细胞发生凋亡是SCI二次损伤的关键因素，凋亡几乎发生于脊髓所有类型细胞中。研究发现，TNF-α可能参与该过程〔11〕。 本研究与前期其他人的结果一致，如Zhu等〔12〕研究也发现，TNF-α mRNA在SCI后1 h SCI区的表达就明显上调。本研究表明，TNF-α是SCI后引发一系列不良反应的重要因素，降低TNF-α将有助于减轻SCI的症状。rMSCs移植组的TNF-α表达水平低于对应时间点的对照组，可见rMSCs 移植有利于降低损伤脊髓TNF-α表达，从而减轻损伤局部的炎症程度，有助于损伤区域神经功能的恢复〔13〕。

综上所述，本研究通过对SCI的大鼠进行MSCs移植后，应用RT-PCR方法检测NGF、TNF-α的mRNA表达水平，初步探讨了rMSCs移植治疗SCI的作用机制，即：rMSCs移植可通过维持NGF的持续高表达，同时抑制炎性因子TNF-α的表达，从而修复受损神经，并尽量减轻SCI炎症反应和继发损伤，为SCI的治疗带来新的曙光。rMSCs移植治疗SCI的工作仍需要后续更多深入的研究。

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2郑 竑,张 韬,林振恩,等.骨髓间充质干细胞靶向移植和促红细胞生成素联合治疗脊髓损伤〔J〕.中华实验外科杂志,2016;33(11):2490-2.

3Donovan L,Francis L,Muter P,etal.Spinal cord injuries:overcoming barriers to seamless care for patients〔J〕.Br J Nurs,2017;26(6):324-30.

4Yan X,Huang G,Liu Q,etal.Withaferin A protects against spinal cord injury by inhibiting apoptosis and inflammation in mice〔J〕.Pharm Biol,2017;55(1):1171-6.

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10Farahabadi A,Akbari M,Amini Pishva A,etal.Effect of progesterone therapy on TNF-αand iNOS gene expression in spinal cord injury model〔J〕.Acta Med Iran,2016;54(6):345-51.

11许子星,许卫红,张立群,等.过表达微小RNA-223脊髓来源神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤〔J〕.中华实验外科杂志,2016;33(11):2485-9.

12Zhu WB,Wang YH,Sun GF,etal.Protective effect and mechanism of probucol in the treatment of spinal cord injury〔J〕.Genet Mol Res,2015;14(3):8029-37.

13Amini Pishva A,Akbari M,Farahabadi A,etal.Effect of estrogen therapy on TNF-α and iNOS gene expression in spinal cord injury model〔J〕.Acta Med Iran,2016;54(5):296-301.