脂多糖在人缺氧诱导心肌细胞凋亡中的作用及相关机制

杜 锋

(甘肃省第二人民医院急诊科，甘肃 兰州 730000)

脂多糖是引发炎症和休克的主要介质之一，可诱导心肌细胞炎性因子表达，引发心肌细胞肥大、凋亡，导致充血性心力衰竭〔1〕。心肌损伤是导致难治性低血压及脓毒症死亡的主要因素，通过体外缺氧处理可较好地模拟体内心肌缺血状态〔2〕。微小RNA(miRNA)在细胞多种代谢途径中起到关键调控作用。相关研究显示，miRNA参与了脂多糖的病理生理过程，脂多糖可通过影响miRNA表达进而调节细胞凋亡和炎症反应〔3〕。最新研究发现，miR-211在卵巢癌等多种肿瘤细胞中异常表达，而Sirt1可能是miR-211潜在的作用靶蛋白〔4〕。本研究旨在探究miR-211/ Sirt1信号通路在脂多糖对心肌细胞损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 肥大心肌组织取自甘肃省第二人民医院行风心病换瓣手术的患者二尖瓣乳头肌；脂多糖购于北京中生瑞泰科技有限公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒、细胞增殖与活性检测(CCK-8)试剂盒、蛋白裂解液购于上海玉博生物科技有限公司；RT-PCR逆转录试剂盒、Sybr GreenⅡ购于北京亚太恒信生物科技有限公司；Sirt1抗体购于美国CST中国分公司。

1.2方法

1.2.1心肌细胞分离与纯化 取二尖瓣乳头肌组织，剪成边长为1 mm3的正方体组织糜，3 g/L胰蛋白酶和1 g/L胶原酶消化后收集悬液，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，3 000 r/min离心10 min，弃上清，培养基悬浮，接种在3 cm细胞培养皿中，差速贴壁法在细胞培养箱中孵育2 h，将培养液离心后再次接种到培养基中，细胞密度约为6×105/L，每3 d换液1次，取4～6 d细胞进行实验。细胞经电镜、免疫组化鉴定，除肥大外无其他病变。加入不同浓度脂多糖进行处理6 h后将其分为对照组、40 μg/ml脂多糖组及60 μg/ml脂多糖组。

1.2.2缺氧条件下培养心肌细胞 先用大培养皿将DMEM培养基展开放入低氧(3%O2、5%CO2、95%N2)培养箱中培养3 h，取4～6 d状态良好的原代心肌细胞，弃去原培养液，滴加胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，光学显微镜下观察，多数细胞变圆、突起收回时用吸管去除酶溶液，加入3～4 ml经低氧饱和处理的DMEM培养基，放入37℃的3%O2、5%CO2、95%N2培养箱，在此缺氧条件下培养24 h，再放回22%O2、5%CO2的培养箱中4 h。

1.2.3原位末端标记(TUNEL)测定凋亡细胞 采用TUNEL法标记凋亡细胞，取3组细胞，用10%中性甲醛溶液固定20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用0.3% TRITONX-100通透10 min，PBS洗涤后按1∶9比例混合A液和B液，将配成的TUNEL反应混合液均匀覆盖到细胞表面，常规培养2 h，PBS洗涤后用含DAPI的HOCHEST封片，荧光显微镜下定量分析。

1.2.4qRT-PCR检测miR-211表达水平 分别于脂多糖处理前后、缺氧诱导后使用RNAiso试剂提取3组细胞的总RNA，逆转录得到cDNA，PCR扩增引物由北京亚太恒信生物科技有限公司合成。反应体系10 μl，cDNA 1 μl、上下游引物各1 μl、dNTP 1 μl、蒸馏水6 μl，进行标准PCR扩增步骤。对混合反应物进行变性处理，共40个循环(95℃ 40 s变性，60℃ 30 s退火，72℃ 40 s延伸)，之后在72℃ 5 min最终扩增。以U6为内参，计算miR-211相对表达量。

1.2.5Western印迹检测 蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量。分别取30 μg总蛋白行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，湿法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭后滴加Sirt1抗体(1∶1 000)，β-actin单抗为内参，4℃培养过夜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，继续培养4 h电化学发光(ECL)显色后置于暗室中显影、定影，分析各条带灰度值。

1.3统计学分析 采用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1脂多糖对缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用 脂多糖组心肌细胞凋亡率明显高于对照组(3.40%±0.81%，P<0.05)；60 μg/ml脂多糖组(9.38%±1.40%)明显高于40 μg/ml脂多糖组(7.16%±1.17%，P<0.05)。见图1。

图1 脂多糖对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响(×200)

2.2脂多糖对心肌细胞中miR-211表达的影响 脂多糖处理前，3组细胞中miR-211相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)；脂多糖处理6 h和缺氧诱导后，40、60 μg/ml脂多糖组细胞中miR-211相对表达量均明显高于同期对照组和脂多糖处理前(P<0.05)，其中60 μg/ml脂多糖组上升更明显。见表1。

表1 脂多糖诱导对3组心肌细胞中miR-211表达的影响

与同期对照组比较：1)P<0.05；与脂多糖处理前比较：2)P<0.05

2.3miR-211上调对靶蛋白Sirt1表达的影响 脂多糖处理前，对照组、40、60 μg/ml脂多糖组Sirt1蛋白相对表达量(1.88±0.35、1.91±0.47、1.76±0.68)差异无统计学意义(P>0.05)；脂多糖处理6 h后和缺氧诱导后，40 μg/ml脂多糖组(0.75±0.20，0.44±0.28)、60 μg/ml脂多糖组(0.62±0.24，0.37±0.14)均明显低于同期对照组(1.86±0.41，1.79±0.36；P<0.05)，其中60 μg/ml脂多糖组Sirt1表达量下降更明显。见图2。

图2 脂多糖对3组心肌细胞中Sirt1表达的影响

3 讨 论

miRNA是一类具有调控功能的非蛋白编码RNA，在维持细胞生长、凋亡方面具有重要意义；其在免疫系统和部分炎症反应中也具有重要调控作用〔5〕。相关研究发现，上皮细胞可在脂多糖作用下下调miR-16表达，上调促凋亡因子FoxA1表达，发挥诱导细胞凋亡的作用〔6〕。动物实验显示，通过盲肠结扎穿孔建立小鼠脓毒症模型，miR-216表达水平增加，心肌细胞凋亡率降低，保护心肌正常功能，缓解心肌损伤〔7〕。

miR-211在多种肿瘤细胞中表达异常，在肿瘤细胞增殖、浸润、转移中发挥重要作用。相关研究显示，结合miR-211靶向治疗可明显增加神经瘤胶质细胞凋亡率和DNA损伤情况〔8〕。部分miRNAs还可调控靶蛋白Sirt1的表达，人结肠癌细胞中miR-42a可通过Sirt1调节细胞凋亡；miR-184可通过调节Sirt1表达在心肌细胞凋亡中发挥重要作用〔9，10〕。上述研究均提示miRNAs可通过调控Sirt1表达来影响心肌细胞凋亡。本研究结果提示，脂多糖促进缺氧诱导心肌细胞凋亡具有特殊性。进一步对诱导心肌细胞凋亡的机制进行分析，提示脂多糖促进缺氧诱导的心肌细胞凋亡可通过上调miR-211水平来抑制Sirt1的表达参与缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程。

1薛大忠,赵自刚,牛春雨,等.线粒体损伤及其在心肌细胞损伤中的作用〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(1):223-7.

2康 波.miRNA-1在硫化氢抑制心肌细胞凋亡过程中的功能及机制〔D〕.上海：第二军医大学,2011.

3李 熠.TGR5在高糖诱导小鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制〔D〕.泸州：四川医科大学,2015.

4林 林,蒋婷婷.大豆异黄酮对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化的保护作用〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2014;15(6):739-42.

5姚新亮,闫成芸,张 韩,等.他汀类药物对心肌缺血再灌注心肌细胞 Bax 和 Bcl-2表达的调控〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(19):4726-8.

6许晓玲.CYP11A1、CYP 2E1在IGF-1通过线粒体机制保护心肌细胞免于凋亡中的作用〔D〕.湛江：广东医学院,2013.

7吴柱国.胰岛素样生长因子1保护心肌细胞免于凋亡机制的探讨〔D〕.广州：广州医学院,2010.

8王海珠.氯吡格雷抵抗对伴糖尿病的冠心病患者冠脉介入预后影响及相关因素〔J〕.中国卫生工程学,2017;16(2):234-5.

9吴婷婷.X盒结合蛋白1在糖尿病心肌病心肌细胞凋亡中的作用机制研究〔D〕.济南：山东大学,2012.

10梅文静.胰岛素生长因子1对大鼠心肌细胞BTEB、SP1基因表达调控及相关抗凋亡机制的研究〔D〕.湛江：广东医学院,2011.