高蛋氨酸饮食对大鼠颈动脉基因甲基化的影响研究

张 岩,陈立杰,常明秀,靳京美,王 锐

(1.哈尔滨医科大学附属第一医院 神经内科，哈尔滨150001；2.哈尔滨医科大学附属第二医院,哈尔滨150086；3.哈尔滨医科大学附属第四医院,哈尔滨150001；4.大庆龙南医院，黑龙江 大庆163000)

近年来我国因脑血管疾病死亡的人数逐年上升，对其危险因素的研究已成为近几年的热点。1969年McCully首次报道动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)患者血浆中HCY升高，使人们意识到HCY可能是除高血压、高血脂、糖尿病等疾病外又一重要的脑血管疾病危险因素,随后的研究发现AS时有DNA异常甲基化表达的现象[1]。现已证实,许多调节细胞增殖或凋亡基因的甲基化改变与AS的关系密切，如雌激素受体基因、P53基因等[1,2]。可以确定基因的甲基化改变是AS发生的重要机制之一[3]。而HCY的前体物质SAH作为甲基供体，与AS的关系十分密切。本实验主要研究高蛋氨酸饮食与颈动脉基因甲基转移酶的关系，进而探讨AS的发生机制，以便合理改善饮食结构，减少脑血管疾病的发生。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1实验模型制备：成年、雄性、健康wistar大鼠21只，体重(100±10)g，由长春实验动物中心提供。采用随机分组的方法将大鼠分为正常对照组(C组)、实验组(M组)和干扰组(F组)，每组7只。实验组饲喂食含1%蛋氨酸的全日饲料，干扰组饲喂食含有1%蛋氨酸、0.003%叶酸、0.00002%维生素B12的全日饲料，对照组饲喂食普通饲料，饲料由春龙实验动物饲料机械厂提供，模型制备期为10周。

1.1.2样品的采集与处理 在喂养10周后，大鼠禁食水24 h，剥离大鼠颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，留取动脉血约10 ml，3 000 r离心后取上清液分装于EP管中，于-80℃保存，留待进行后续试验。迅速取下颈动脉约1 cm，于4℃PBS中迅速剥离多余的脂肪、筋皮等结缔组织，冲洗干净血管内残留的血液，在滤纸上将残留的PBS吸去后置于冻存管中放入液氮后于-80℃冻存，用于检测甲基转移酶蛋白表达水平和整体基因甲基化水平。

1.2 方法

1.2.1大鼠的体重测定 分别于第0、4、8、10周时给老鼠称重并进行记录。

1.2.2血浆HCY和SAH浓度测定 从-80°冰箱取出血浆标本，在室温下静止10 min后，采用化学发光微粒子免疫检测法(雅培i2000化学发光仪)、酶联免疫吸附法(ELISA)分别测定HCY和SAH浓度。

1.2.3Western blot检测甲基转移酶的表达 取适量组织裂解、匀浆，离心提取蛋白；采用BCA试剂盒绘制出蛋白标准曲线并进行蛋白浓度测定。制备浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为7%、10%，分别取上样液20ìl、含30ìg蛋白进行电泳；将分离的蛋白转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h。随后用1:200 Dnmt抗体4℃过夜，TBS充分洗涤，再将该膜用1∶500羊抗兔IgG-HRP抗体室温孵育45 min，TBS充分洗涤，最后使用ECL试剂盒显影、定影、洗片。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 实验期间三组大鼠体重变化情况

实验期间，严格按照饲养管理标准饲养大鼠，三组大鼠体重逐渐增加，未见发生其他疾病而死亡的大鼠。对照组大鼠发育良好，表现正常；实验组大鼠初期精神状态尚可，但随着时间的延长逐渐出现反应减慢，活动迟钝，7周后偶有大鼠出现行走略不稳，摄食及饮水量较对照组减少；干扰组大鼠精神状态好，对声音刺激敏感，运动异常活跃，偶有精神过度紧张，摄食及饮水量较对照组和实验组略多。

喂养4周后，三组大鼠体重开始有差异，但差异无统计学意义(P>0.05)；喂养8周开始，实验组体重明显低于对照组和干扰组，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 实验期间三组大鼠体重变化情况

注：a：实验组与对照组相比，P<0.05；b：实验组与干扰组相比，P<0.05。

2.2 实验期满三组大鼠血浆HCY和SAH浓度测定结果

实验期满，经过不同饲料饲养后，实验组大鼠血浆HCY浓度均高于对照组和干扰组，经过叶酸和维生素B12干扰后，干扰组血浆HCY浓度虽然高于对照组，但明显低于实验组,而血浆SAH浓度实验组低于对照组，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表3 三组大鼠血浆HCY和SAH浓度测定结果

注：a：实验组与对照组相比，P<0.05；b：实验组与干扰组相比，P<0.05。

2.3 实验期满三组大鼠甲基转移酶蛋白1和3a的蛋白表达情况

实验期满，经过不同饲料饲养后实验组大鼠甲基转移酶1和3a的蛋白表达均低于对照组和干扰组，经过叶酸和维生素B12干扰后，干扰组大鼠甲基转移酶1和3a的蛋白表达虽然低于对照组，但明显高于实验组，且差异具有统计学意义(P< 0.05)，见图1。

注：*表示实验组与对照组相比，P<0.05；**表示干扰组与实验组相比，P<0.05

实验期满时所测甲基转移酶3b表达情况，三组所得数据比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 甲基转移酶蛋白3b的蛋白表达

3 讨论

有研究表明，HCY在体内的含量增高时，可以在氨基酰-tRNA合成酶的催化下，生成同型半胱氨酸硫内酯(homocysteine thiolactone，HTL)。组织细胞培养研究发现,HTL只需要极少的浓度(0.05 mmol/L)就可以使血管内皮细胞发生凋亡，其机制可能与诱导氧化应激以及NF-êB活化、诱导人HL-60细胞的凋亡[4]有关。而HCY本身也可以引起细胞凋亡，其浓度是(3 mmol/L)，可见，HCY及其生成的HTL均具有明显的细胞毒性作用[5]。同时人们还发现HCY的神经毒性作用，在脑血管病及脑外伤时，10 μmol/L的HCY即可通过过度兴奋N-甲基-D-天冬氨酸受体产生钙离子内流，引起大量的活性氧生成，从而产生神经毒性作用。这种神经毒性作用使得人的认知功能受到严重损伤,所以，人们认为HCY是老年痴呆的一个独立的危险因素[6]，并且起到一定的预测作用[7]。

本实验研究发现，高蛋氨酸组大鼠体重明显减轻，精神状态、反应速度均较正常对照组减弱，活动量少，偶有大鼠出现肢体力弱，行走不稳。给予叶酸及维生素B12干扰后的大鼠摄食饮水量及体重较对照组均增加，精神状态良好，对声音光线刺激敏感。说明高蛋氨酸饮食对于大鼠确实具有细胞毒性和神经毒性作用，叶酸、维生素B12具有神经保护作用。

高蛋氨酸饮食引起的高HCY血症，可以引起甲基化异常及基因表达紊乱，同时血管动脉粥样硬化改变中存在异常甲基化，这引起了我们对甲基化、同型半胱氨酸、血管动脉硬化三者关系的思考[8]。有研究结果表明，增加HCY浓度可以反馈性地抑制SAH水解酶导致SAH的浓度升高，同时导致SAM浓度的减少，并使SAM/SAH的比值降低，从而下调了DNA甲基化状态[9,10]。刘玲娟等的研究亦显示在HCY浓度升高可以引起平滑肌细胞整体基因组去甲基化改变的同时，人脐动脉平滑肌细胞内源性DNMT1的活性同步下降，因此，推测DNMT1与Hcy引起的平滑肌细胞增殖有关[11]。可见，HCY引起DNA低甲基化，同时与血管动脉硬化的关系密切。

本实验结果显示，经过高蛋氨酸饮食喂养大鼠后，血浆HCY浓度实验组明显高于对照组和干扰组，说明高蛋氨酸饮食可以引起高HCY血症，而大鼠颈动脉甲基转移酶1和甲基转移酶3a的表达实验组均较对照组和干扰组明显减低，这与HCY血浆浓度变化呈一致性，说明高HCY血症可以使甲基转移酶1和3a表达减低，进而引起低甲基化表达。本实验同时证明叶酸和维生素B12不仅可以拮抗高蛋氨酸饮食诱导的高HCY血症，也可以拮抗高HCY血症引起的甲基转移酶低表达。以往的研究亦证明叶酸水平和甲基转移酶1蛋白表达改变在宫颈癌变过程中有协同作用，可见，叶酸和甲基转移酶关系密切[12]。与本实验结果相符。

以往有研究表明高蛋氨酸饮食可以增加SAH的血浆浓度，与本实验结果相反，但亦有实验证明高HCY可以使甲基转移酶的活性代偿性增高，导致SAM大量消耗，引起SAM的浓度减少[13]。我们考虑：SAH作为SAM的代谢产物与SAM的含量有直接关系，高HCY血症引起的SAM的高消耗，可能是SAH的含量减低的因素之一。并且SAH在血中含量低，且其测定方法复杂，进行大规模血浆SAH测定具有一定的难度，所以，对SAH与高蛋氨酸饮食的关系、与甲基转移酶蛋白表达的关系仍需进一步研究。

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