微湿布条DNA检验

叶 娟，赵 敏，章冬青

（1，3.安徽省天长市公安局刑事科学技术室，安徽 天长 239300；2.江苏省宿迁市沭阳县公安局，江苏 沭阳 223600）

目前制约接触DNA检验成功率的瓶颈主要在接触DNA检材的发现和提取上，如何从微量接触检材中提取到足够量的DNA，得出完整的STR基因分型图谱，以满足法医检验需要，为侦查破案指明方向，已成为每一个DNA技术工作者研究的课题。硅珠法是提取和纯化DNA的常用方法之一，适用于各类生物检材，尤其适用于腐败、污秽等检材，具有经济、简便、快速等优点。但由于常规硅珠法实验操作复杂，实验过程中模板DNA量损失较大，对微量检材的检验效果欠佳。本文通过对硅珠法进行了改良，与常规硅珠法进行比较，得出不同的检测图谱，验证了采用改良硅珠法更易得到完整的STR基因分型图谱，为硅珠法的改进提供强有力的证实。

一、案情简介

2017年11月13日，安徽省天长市铜城镇龙岗社区联盟队丁某福家被人剪锁入室，被盗三十五只老母鸡。接警后，DNA实验人员与现勘人员同步到达现场，对现场进行研判，被盗现场为简易搭建的牲畜棚，但由于近期阴雨连连，加之嫌疑人反侦查意识强，中心现场条件十分有限，技术人员立即向外勘查，在外围现场的墙角处提取一份微湿布条送检。该检材被雨水淋湿，DNA含量较低，检验难度较大，对检验人员是极大的考验。检验人员考虑到各种因素，采用了改良硅珠与常规硅珠法提取，最终检出一完整男性STR基因分型图谱，成功比中盗窃前科人员王某某，从而破获系列盗窃家禽案。

二、检材与方法

（一）DNA 提取

生物样本的采集：用剪刀直接将潮湿布条褶皱较多处剪碎，分成均等的两份，一份置于1号离心套管采用改良硅珠法提取DNA，一份置于2号离心管采用常规硅珠法进行处理。

（1）改良硅珠法：采用D-盾超敏DNA提取试剂盒（上海惠文生物技术有限公司）。在1号离心套管中加入裂解液 180ul，99oC裂解 10min，16000r/min离心2min，弃套管后在离心液中加入1000ul吸附液（12gGuSCN 溶于 10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)，加入 0.8ml 0.5mol/L EDTA 和 0.5ml TritomX-100），硅珠 20ul，涡旋后静置 15min，8000r/min 离心 1min，弃上清，加入400ul漂洗液 （12g GuSCN溶于10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)），充分混匀后8000r/min离心1min，弃上清；重复漂洗一次；56oC金属浴烘干沉淀物，加入20ul洗脱液，充分混匀后56oC金属浴15min；16000r/min离心2min，取上清进行PCR。[1]

（2）常规硅珠法：在2号离心管中加入缓冲消化体系（TES100ul，SLS20ul，PK5ul）。震荡，水浴 3h，将水浴后的离心管，加入三倍的吸附液（375ul），震荡，12000r/min离心2min，转移至另一个新的3号离心管中，加入硅珠15ul，静置15min，将静置好的3号离心管离心（12000r/min，2min），弃上清，重复一次；加入200ul的70%冷乙醇漂洗1次，弃上清，重复一次；99oC烘干沉淀物，加入15ul纯水，充分混匀后56oC金属浴15min；12000r/min离心2min，取上清进行PCR。[2]

（二）PCR 扩增

扩增在Veriti System （Thermo Fisher公司，美国）上进行。使用ID plus试剂盒，10 ul扩增体系，内含模板 DNA 为 2.0ul，mix4ul，primer2ul，纯水 2ul。反应条件为 95oC11min，94oC20s，59oC3min，共 28 个循环；60oC11min。[3]

（三）电泳分析

PCR扩增产物应用ABI-3500XL型DNA序列分析仪电泳分离和激光扫描分析 （Thermo Fisher公司，美国），采用GeneMapperID-X软件分析STR基因型。操作步骤按照试剂与仪器说明书进行。

三、结果

按照图谱峰值在50RFU以上视为检出、200RFU及以上为可用数据，统计采用改良硅珠法和常规硅珠法所得图谱峰值在50RFU及以上的基因座。结果显示：采用常规硅珠法提取DNA，大片段位点丢失严重，未能得到完整STR基因分型图谱，且峰值高度和平衡性欠佳（如图1）；采用改良硅珠法提取DNA，可得到16个基因座的完整STR基因分型图谱，且峰值水平相当，分型准确（如图2）。验证采用改良硅珠法提取接触性DNA更易得到完整的STR基因图谱。

图1 微湿布条STR分型图谱（常规硅珠法）

图2 微湿布条STR分型图谱（改良硅珠法）

四、讨论

随着DNA检验技术的普及和发展，在各级公安机关侦查破案中发挥着杀手锏的作用，侦查员利用DNA技术破案的意识日益增强，与此同时，犯罪嫌疑人的反侦查意识也逐渐提高，遗留在现场中的生物检材已由烟蒂、血迹等常规性检材转变为存在形式特殊的非常规性生物检材，即接触性DNA。接触DNA是指通过皮肤接触遗留在客体表面的DNA，主要来源于人体皮肤脱落的上皮细胞[4]。采用常规提取方法难以获得高质量的DNA模板。本案中的微湿检材属于接触性DNA，微量生物检材，实际检验时，难度较大。

处理接触性DNA的生物检材方法很多，如胶带粘取法[5]、两步擦拭法、直接剪取法、负压吸附法[6]、震荡冲洗法[7]，DNA检验技术人员根据长期积累的经验，针对不同检材采取不同方法。每种方法都有其优缺点，本论文中采用直接剪取法，操作简单，易获得单一基因型，但是会破坏检材的完整性，将载体置于裂解液中也会影响DNA的质量。

在法医DNA物证检验中，微湿检材易受到水的酸碱度、温度、微生物等未知因素的影响，DNA含量低，易于降解，加之提取和处理环节较复杂，不易检出完整的STR基因分型。有报道称，适当增加吸附液和硅珠量同时减少洗脱体系可提高硅珠法回收模板DNA的浓度。[8]

硅珠法是提取和纯化DNA的常用方法之一，适用于各类案件的检材，尤其是腐败、污秽等微量生物检材，具有经济、简便、快速等优点。硅珠法是在高浓度硫氰酸胍存在条件下，DNA被二氧化硅特异性地吸附，当条件消失后，被解离下来。由于裂解比较充分，而且硫氰酸胍的存在和漂洗过程可以将杂质及PCR抑制物除去，从而获得纯度高的DNA[9]。硅珠法可在0.5～1ul新鲜血液中提取出足以成功扩增的DNA，提取灵敏度与聚苯乙烯二乙烯基苯树脂法相当，且不受检材种类和条件的限制，提取时限短，适用于绝大多数案件现场检材的处理。

本实验中采取改良硅珠法和常规硅珠法作为对照提取微量生物检材中DNA，改良硅珠法省去繁琐的移管步骤，减少漂洗次数，大大降低了DNA的耗损；同时，适当增加吸附液及硅珠量可保证硅珠与DNA充分结合，小体系洗脱则更易提取到高浓度DNA。常规硅珠法实验操作复杂，实验过程中模板DNA量耗损较大，在DNA提取纯化过程中易受移管、试剂剂量、漂洗步骤等因素的影响，在处理微量生物检材方面效果欠佳[10]。

综上，本文实验结果表明，采用改良硅珠法提取和纯化样本DNA，更易得到完整的STR基因分型图谱。在犯罪现场，一般接触性检材DNA来源于脱落细胞，涉及的检材种类很多，包括各种人体接触的工具、衣物、电动车把手擦拭物等，DNA含量较少，较难提取。采用改良硅珠法对这些检材进行检验，可以有效地减少DNA的降解，操作方便，稳定性较好。